Microscopio láser de dos fotones : un microscopio láser que le permite observar tejidos vivos a una profundidad de más de un milímetro, utilizando el fenómeno de la fluorescencia . Un microscopio de dos fotones es un tipo de microscopio de fluorescencia multifotónica . Sus ventajas sobre un microscopio confocal son su alto poder de penetración y su baja fototoxicidad [1] .
El microscopio de dos fotones fue construido por primera vez por Winfred Denk en el laboratorio de W. W. Webb en la Universidad de Cornell [2] . Combinó la idea de la excitación de dos fotones con el escaneo láser.
El microscopio láser de dos fotones se basa en el principio físico descrito por Maria Goeppert-Mayer en su tesis doctoral [3] en 1931.
El proceso de excitación de dos fotones ocurre de la siguiente manera: dos fotones de baja energía excitan un fluoróforo (una molécula o parte de una molécula capaz de fluorescencia) durante un evento cuántico. El resultado de esta excitación es la posterior emisión de un fotón fluorescente por parte de las moléculas excitadas. La energía del fotón fluorescente es mayor que la energía de los fotones excitantes.
La probabilidad de que ambos fotones de excitación sean absorbidos por una molécula es muy pequeña. Por lo tanto, se requiere un gran flujo de fotones de excitación, que se puede obtener utilizando un láser que emite fotones con una alta tasa de repetición de pulsos (80 MHz). Los fluoróforos más utilizados tienen un espectro de excitación en el rango de 400-500 nm, mientras que la longitud de onda del láser de excitación está en el rango de 700-1000 nm (región infrarroja). Si el fluoróforo absorbe dos fotones al mismo tiempo, recibirá suficiente energía para entrar en un estado excitado. A continuación, el fluoróforo excitado emitirá un fotón (en la parte visible del espectro), cuya longitud de onda depende del tipo de fluoróforo.
Dado que la absorción de dos fotones es necesaria para que el fluoróforo entre en estado excitado, la probabilidad de que el fluoróforo emita un fotón secundario es proporcional al cuadrado de la intensidad de excitación. Por lo tanto, la fluorescencia será más fuerte cuando el rayo láser esté claramente enfocado y no disperso. La máxima fluorescencia se observa en el volumen focal (el volumen donde se enfoca el rayo láser) y muestra una fuerte disminución en la región desenfocada.
En un microscopio de dos fotones, un rayo láser infrarrojo se enfoca utilizando una lente de objetivo convergente . Por lo general, se utiliza un láser de zafiro de alta frecuencia de 80 MHz, que emite un pulso de 100 femtosegundos que proporciona la alta densidad de flujo de fotones necesaria para la absorción de dos fotones.
La luz emitida por una muestra fluorescente se amplifica mediante un tubo fotomultiplicador de alta sensibilidad . Dado que el receptor de luz es de un solo canal, la intensidad de la luz observada en un volumen focal dado forma un píxel de imagen . Para obtener una imagen bidimensional de píxeles, se realiza un escaneo en el plano focal de la muestra.
El uso de luz infrarroja para excitar el fluoróforo en los tejidos estudiados tiene sus ventajas [4] :
Pero también hay algunas desventajas: