DNase-seq

La prueba de susceptibilidad DNase-Seq o DNase  es un método de biología molecular, junto con FAIRE-Seq , que se utiliza para determinar la posición de las regiones reguladoras. El método se basa en la secuenciación de regiones hipersensibles a la escisión de DNase I. DNase-Seq se utiliza para determinar la distribución global de los sitios de escisión de DNase I y, por lo tanto, la cromatina abierta, donde a menudo se localizan los elementos reguladores. DNase-Seq es particularmente atractivo para identificar elementos reguladores porque no depende de la presencia o especificidad de anticuerpos.

Justificación teórica

El empaquetamiento del ADN en los nucleosomas juega un papel estructurante y es un factor importante para la transcripción que determina la capacidad del ADN para unirse a las proteínas. Esto facilita la replicación y coordinación de la actividad génica [1] .

Hablando de la accesibilidad de la cromatina, se distinguen dos de sus conformaciones: abierta y cerrada. La conformación cerrada corresponde al ADN empaquetado en nucleosomas y estructuras de orden superior. Los primeros estudios han demostrado que las regiones de ADN fuera del nucleosoma (conformación abierta) son hipersensibles a la ADNasa I y son responsables de la activación de genes [2] [3] [4] [5] [6] . Durante los últimos 25 años, se han identificado cientos de sitios hipersensibles mediante transferencia de Southern convencional. El mapeo de estos sitios ha contribuido significativamente a la identificación de varios tipos de elementos reguladores del genoma: promotores, potenciadores, silenciadores y aislantes. La identificación de los elementos activos de la regulación génica es necesaria para comprender la regulación de los procesos biológicos a nivel de la transcripción [7] . Estos procesos incluyen la diferenciación, el desarrollo, la proliferación de células y su respuesta a las influencias ambientales.

El método DNase-seq, descrito por primera vez en 2008, se basa en la escisión selectiva por parte de DNasa I de estas regiones importantes para la regulación de procesos biológicos que no forman parte de los nucleosomas.

Procedimiento

• cultivo celular homogéneo
• trifosfatos de desoxinucleósido
• granos de estreptavidina
• Los enlazadores son secuencias de oligonucleótidos recocidas.
• cebador de secuenciación
• cebadores para PCR
• T4 ADN ligasa
• ADN polimerasa T4

1. Aislamiento de núcleos
   • Después de la centrifugación y el lavado con un tampón de aproximadamente 50 millones de células, la suspensión resultante se mezcla a fondo con el tampón de lisis.
   • Teñir azul tripán para comprobar la calidad de la lisis. Si la lisis tuvo éxito, el 99% de las células deberían teñirse.
   • Centrifugar para sedimentar los núcleos y eliminar completamente el sobrenadante.
2. Digestión con ADNasa I e incorporación de ADN en agarosa
3. Identificación de productos de tratamiento de ADNasa por electroforesis en PFG (pulse field gel).
4. Despuntado de los extremos sobresalientes resultantes.
5. Creación de una biblioteca. Se hibridan dos pares de secuencias de oligonucleótidos para crear dos enlazadores. Los extremos tratados con ADNasa luego se ligan a uno de los enlazadores. Después de eso, los enlazadores no ligados deben separarse del ADN ligado y aislarse entre sí.

Luego, el ADN ligado se trata con la endonucleasa de restricción MmeI, lo que da como resultado extremos desfosforilados. Deben estar ligados a un segundo enlazador (fosforilado).

De este modo, se obtiene un producto DNase-seq. Se amplifica y se realiza electroforesis con el producto de amplificación.

Después de mapear las lecturas, el ruido de fondo de la digestión aleatoria de ADNasa I (que suele ser mucho más débil que la real) se elimina comparando la señal en esa posición con una gran región flanqueante y la señal de fondo esperada. Los límites nítidos entre los DHS vecinos se suavizan en programas como F-seq [8] , basado en algoritmos como HotSpot, optimizado para trabajar con datos obtenidos utilizando diferentes protocolos [9] [10] [11] .

• El método solo funciona con muestras recién preparadas y excluye el uso de muestras congeladas o fijadas de otro modo.
• El tiempo de lisis y las concentraciones de detergente deben optimizarse para lograr la máxima eficiencia de lisis y mantener intacta la mayoría de los núcleos. En caso de lisis exitosa, el número de núcleos obtenidos en comparación con el número inicial de células debe estar entre el 80 y el 100%.
• La selección de tamaño antes y durante la construcción de la biblioteca influye directamente en la presentación de sitios de ADNasa I fuertes y débiles.
• El seguimiento de la eficiencia y la especificidad del enriquecimiento de la ADNasa I mediante PCR cuantitativa o transferencia Southern es importante para mejorar los datos obtenidos. En base a estos datos, la concentración de DNase I se puede ajustar para lograr un enriquecimiento óptimo.

• Según el método, se recomienda analizar 50 millones de células. ¿Qué hacer si no hay suficientes células?
  • También se realizaron experimentos con un número menor de células. Es posible recalcular concentraciones y volúmenes en proporción al número de células, sin embargo, en general, todas las proporciones se determinan empíricamente en función del número y tipo de células.
• Las células se lisaron pobremente de manera insuficiente o, por el contrario, excesivamente. La lisis excesiva de las células puede conducir a su adhesión y precipitación.
  • Es necesario elegir la concentración correcta del agente de lisis. Diferentes líneas celulares tienen diferente susceptibilidad a dichos agentes. Deben probarse diferentes concentraciones en un pequeño número de células (5 millones).
• El ADN no fue cortado total o excesivamente por la ADNasa.
  • Como en el caso de la lisis, la concentración juega un papel decisivo. Si el corte no es lo suficientemente eficiente, aumente la concentración de enzima o el tiempo de procesamiento o tome una cantidad menor de células. En caso de sobreprocesamiento, el efecto de la DNasa debe reducirse y debe tomarse a una concentración más baja.

Comparación con otros métodos

Los datos de DNase-seq se correlacionan con los datos de DNase-ChIP. Los resultados obtenidos por ambos métodos se correlacionan con los resultados de la PCR cuantitativa [12] . Sin embargo, hay muchas diferencias entre estos métodos. DNase-seq, a diferencia de DNase-ChIP, solo se usa para experimentos de genoma completo. DNase-ChIP es menos preciso pero más flexible y puede usarse para estudiar regiones individuales del genoma.

DNase-seq es un método directo aplicable a células de cualquier tipo de cualquier especie cuyo genoma haya sido secuenciado [13] . DNase-seq es muy conveniente para identificar los elementos reguladores del genoma en una primera aproximación. Sin embargo, este método no explica directamente las funciones biológicas de estos elementos. Se deben utilizar otros métodos, como la inmunoprecipitación de cromatina, para determinar las funciones de los elementos reguladores .

Existen algoritmos bioinformáticos que pueden procesar datos experimentales sin procesar y realizar un análisis más completo del genoma. Por ejemplo, hasta un nucleótido, es posible determinar los sitios donde el ADN se ha unido a las proteínas, los llamados. trazas de proteína [14] . Si las trazas de proteínas y los sitios hipersensibles se agrupan en grupos con funciones biológicas más claras y se correlacionan con datos sobre secuencias reguladoras del genoma, se puede concluir cómo la accesibilidad a la cromatina afecta la interacción del ADN con los factores de transcripción.

Hay un servidor disponible públicamente que contiene datos de DNase y ChIP-seq para humanos y ratones.

Proyecto ENCODE

Uno de los objetivos del proyecto ENCODE es mapear todos los sitios hipersensibles del genoma humano para sistematizar el ADN regulador [15] . Usando secuenciación de alto rendimiento, se obtuvo un perfil de sitios hipersensibles para 125 tipos de células humanas. Como resultado, se identificaron 2,9 millones de sitios hipersensibles. El 34 % eran específicos de cada tipo celular y solo se encontró una pequeña cantidad en todos los tipos celulares. Estos datos dan una idea de la gran complejidad de la regulación de la expresión en el genoma humano y la cantidad de elementos que controlan esta regulación [16] .

Si DNase-seq puede reemplazar ChIP-seq y en qué medida es un tema para futuras investigaciones.

Notas

1. ↑ Cockerille P.N. Estructura y función de la cromatina activa y los sitios hipersensibles a la ADNasa I   // FEBSJ . - 2011. - Edicion. 277 . — pág. 2182–2210 .
2. ↑ Wu C. Los extremos 5' de los genes de choque térmico de Drosophila en la cromatina son hipersensibles a la DNasa I   // Nature . - 1980. - Edicion. 286 . - P. 854-860 .
3. ↑ Wu C, Wong YC, Elgin SC. La estructura de la cromatina de genes específicos: II. Alteración de la estructura de la cromatina durante la actividad génica   // Cell . - 1979. - Edicion. 16 _ - Pág. 807-814 .
4. ↑ Levy A, Noll M. Estructura fina de cromatina de genes activos y reprimidos   // Nature . - 1981. - Edicion. 289 . — pág. 198-203 .
5. ↑ Gross DS, Garrard WT. Sitios hipersensibles a la nucleasa en la cromatina  //  Annu Rev Biochem. - 1988. - Edicion. 57 . — pág. 159-197 .
6. ↑ Keene MA, Corces V, Lowenhaupt K, Elgin SC. Los sitios hipersensibles a la ADNasa I en la cromatina de Drosophila se encuentran en los extremos 5' de las regiones de transcripción  //  Proc Natl Acad Sci. - 1981. - Edicion. 78 . - P. 143-146 .
7. ↑ Song L. y Crawford G.E. DNase-seq: una técnica de alta resolución para mapear elementos reguladores de genes activos en todo el genoma de células de mamíferos  (inglés)  // ColdSpringHarb.Protoc.. - 2010. - P. 1-11 .
8. ↑ Boyle, AP, Guinney, J., Crawford, GE, Furey, T.S. F-Seq: un estimador de densidad de características para etiquetas de secuencia de alto rendimiento   // Bioinformática . - 2008. - Edicion. 24 . — pág. 2537–2538 .
9. ↑ Sabo, PJ et al. Descubrimiento de elementos no codificantes funcionales mediante análisis digital de la estructura de la cromatina   // Proc . nacional Academia ciencia EE.UU. - 2004. - Edicion. 101 . — Pág. 16837–16842 .
10. ↑ Hardison, RC, Taylor, J. Enfoques genómicos para encontrar módulos reguladores cis en animales   // Nat . Rvdo. Gineta. - 2013. - Edicion. 13 _ - pág. 469-483 .
11. ↑ Zeng, W, Mortazavi, A. Consideraciones técnicas para ensayos de secuenciación funcional  //  Nature Immunology. - 2012. - Edicion. 13 _ - Pág. 802-803 .
12. ↑ Boyle AP, Davis S, Shulha HP, Meltzer P, Margulies EH, Weng Z, Furey TS, Crawford GE. Mapeo y caracterización de alta resolución de la cromatina abierta en todo el genoma   // Cell . - 2008. - Edicion. 132 . - Pág. 311-322 .
13. ↑ Madrigal P, Krajewski P. Enfoques bioinformáticos actuales para identificar sitios hipersensibles a la DNasa I y huellas genómicas a partir de datos de DNasa-seq  //  Frontiers in genetics. - 2012. - Edicion. 3 . - P. 1-3 .
14. ↑ Hesselberth JR, Chen X, Zhang Z, Sabo PJ, Sandstrom R, Reynolds AP, Thurman RE, Neph S, Kuehn MS, Noble WS. Mapeo global de interacciones proteína-ADN in vivo mediante huella genómica digital  //  Métodos Nat. - 2009. - Edicion. 6 _ — pág. 283-289 .
15. ↑ Thurman RE et al. El paisaje de cromatina accesible del genoma humano   // Naturaleza . - 2012. - Edicion. 489 . — pág. 75-82 .
16. ↑ Zhang, W et al. Identificación de todo el genoma de elementos de ADN reguladores y huellas de unión a proteínas utilizando firmas de cromatina abierta en Arabidopsis  //  La célula vegetal. - 2012. - Edicion. 24 . — Pág. 2719-2731 .