Glutamato carboxipeptidasa II

La folato hidrolasa 1 , más conocida como glutamato carboxipeptidasa II ( Glutamato  carboxipeptidasa II, GCPII , o antígeno de membrana específico de la próstata, PSMA ) es una metaloenzima que contiene zinc y pertenece a las glicoproteínas de membrana de clase 2. GCPII cataliza la hidrólisis de N-acetilaspartilglutamato a glutamato y N-acetilaspartato , y también participa en el metabolismo del folato .

Asociación con el cáncer de próstata

El cáncer de próstata es el sexto tipo de cáncer más común y el segundo más letal en los hombres occidentales [1] . El aumento de la mortalidad se asocia principalmente con la metástasis, que aumenta de un estadio a otro. La metástasis se produce a través de las vías linfática y circulatoria, y casi cualquier órgano es un objetivo potencial. Los huesos, el hígado y los pulmones son los más afectados [2] .

El PSMA es un marcador de cáncer de próstata, ya que su expresión en células de cáncer de próstata y células epiteliales de vasos recién formados dentro de otros tipos de tumores [3] es muchas veces mayor que la expresión de este antígeno en otros tejidos. Es especialmente alto en los cánceres avanzados [4] [5] y dentro de las células cancerosas insensibles a las hormonas [6] , que pueden usarse como base de un método para rastrear la progresión del tumor [7] [8] y también en algunas células gliales [9] . Y aunque aún se desconoce la base biológica molecular de la relación entre el desarrollo del cáncer y la expresión de PSMA, el desarrollo de sistemas de estadificación del cáncer, medicamentos contra el cáncer y sus vehículos de administración está en pleno apogeo [3] [7] [10] [11] [12 ] .

Actividad enzimática

La proteína tiene funciones específicas en la célula: es la metaloenzima glutamato carboxipeptidasa II dependiente de Zn (GCPII, esta abreviatura se usa cuando se habla del funcionamiento de la enzima no asociada con el cáncer), que cataliza la hidrólisis del péptido neurotransmisor N- acetilaspatilglutamato (NAAG) a glutamato (también neurotransmisor) y N-acetilaspartato (NAA) [13] (Fig. 1).

Estructura

El GCPII humano consta de 750 residuos de aminoácidos; en el proceso de modificación sufre N-glicosilación y su peso total es de aproximadamente 100 kDa [13] . Consta de varios dominios: N-terminal (dentro de la célula), transmembrana, unión de aminoácidos (fuera de la membrana), dominio catalítico (fuera de la membrana) y dominio de propósito desconocido (fuera de la membrana) (Fig. 2) [13 ] . La actividad enzimática del PSMA se produce sólo después de la homodimerización en sitios de la región extracelular de la proteína [14] . Por lo tanto, un aumento en la cantidad de esta enzima conduce a un aumento en la concentración de glutamato en el espacio intercelular [15] , lo que implica que la GCPII está involucrada en el desarrollo de enfermedades y trastornos neurológicos asociados con daño o muerte de neuronas a altas concentraciones. concentraciones de glutamato [8] [15] .

Endocitosis tras la unión del ligando

Una característica importante del PSMA es su capacidad para internalizarse mediante endocitosis dependiente de clatrina cuando se une a un sustrato similar a un ligando [16] . Anticuerpos [16] , aptámeros de ADN/ARN [17] , varios compuestos de bajo peso molecular [18] [19] pueden actuar como sustrato . Se ha demostrado que el motivo MXXXL del dominio citoplasmático del PSMA es esencial para la internalización y mutación de este sitio (en las posiciones 1 y 5), y la adición de aminoácidos adicionales (Ala) conduce a la inhibición del proceso en la próstata. células cancerosas [20] . Además, se sabe que la interacción de los últimos aminoácidos del dominio N-terminal de PSMA con la filamina A (los dímeros de filamina A sirven como sitios de acoplamiento para varios receptores de membrana involucrados en la transducción de señales) reduce la actividad catalítica de PSMA en un 64 %. (la interacción está regulada por mecanismos intracelulares) en células que contienen filamina [19] [21] .

Todo esto, más el hecho de que el PSMA funcional es un homodímero, puede indicar que el PSMA es un receptor de membrana para un ligando desconocido: después de unirse al ligando, el complejo de ligando de PSMA se internaliza. Esto puede confirmarse indirectamente por el hecho de que el PSMA en las células del endotelio vascular se localiza principalmente en las caveolas (invaginaciones de la membrana plasmática en las células de vertebrados, formadas debido a la incorporación de calveolinas) junto con muchos otros receptores y moléculas de señalización [22] .

Si el ligando desconocido es un factor de crecimiento, entonces aumentar el nivel de internalización, como en el caso del receptor del factor de crecimiento epidérmico [23] , puede ser importante para prevenir el proceso de transformación de células sanas en cancerosas [21] . Por el contrario, el aumento de la capacidad de internalización, como en el caso de MT1-MMP (metaloproteinasa de membrana) [24] , puede estimular la formación de metástasis.

Anticuerpos contra PSMA

Por primera vez, se mostró la posibilidad de usar PSMA para la detección de cáncer de próstata usando mAb 7E11 marcado radiactivamente (111In) (anticuerpos monoclonales de ratón) [25] [26] . Se encontró que el epítopo es el dominio intracelular de PSMA [27] . Por lo tanto, solo pueden detectarse células lisadas mecánica o apoptóticamente, o existe alguna otra forma de que el conjugado penetre en la membrana. A pesar de las limitaciones del método, 111In mAb 7E11 es actualmente el único fármaco aprobado por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos, EE. UU.) y se utiliza para la detección [25] [26] [28] .

Sin embargo, el uso del dominio citoplasmático como diana complica la selección y es poco probable que sea útil para estudios de biología molecular. Los primeros experimentos sobre el uso de anticuerpos de ratón (J591, J533, J415, E99, conjugados con un marcador fluorescente) contra epítopos de la región extracelular de PSMA demostraron una ventaja significativa sobre mAb 7E11: la capacidad de teñir células vivas no permeabilizadas [ 29] . De estos, los anticuerpos J591 se han utilizado de forma intensiva como un medio para administrar radiación en la radioinmunoterapia (dirigir la radioterapia directamente al tumor) [30] [31] . J591 se refiere a inmunoglobulinas de clase G; unirlo a PSMA provoca la internalización, con el número de eventos de internalización proporcional a la concentración de J591 [16] .

Los anticuerpos marcados con fluorescencia también se analizan para su uso. Por ejemplo, el conjugado J591 con verde de indocianina, cuya característica es la activación de la etiqueta fluorescente después de que se separa del anticuerpo después de la unión del PSMA (el conjugado no emite fluorescencia), la internalización y la degradación del conjugado en los lisosomas [32] . Además, pequeñas concentraciones del conjugado, iguales a las del radiomarcaje, son suficientes para la detección.

Además de la carga radiactiva y fluorescente, los anticuerpos pueden conjugarse con varios fármacos y toxinas [33] . Actualmente, un gran número de conjugados se encuentran en fase de ensayos preclínicos: mAb E6 + ricina A desglicosilada (proteína toxina de origen vegetal, extremadamente tóxica) [34] ; mAb J591 + péptido similar a la melitina (la melitina es el componente principal del veneno de abeja) [35] ; mAb + MMAE (monometil auristatina E, toxina sintética) [36] , etc..

Desde que la FDA aprobó un método basado en una célula como agente autógeno para inmunoterapia (sipuleucel-T) [37] , ha habido intentos de apuntar a otras proteínas, como el PSMA. El uso del sistema HLA (antígeno leucocitario humano) permitirá, con la ayuda de la respuesta inmune del propio organismo, deshacerse de las células en cuya superficie hay un antígeno, cuyas secciones de secuencia están representadas por el Sistema HLA de una célula presentadora de antígeno modificada ex vivo.

También es posible usar anticuerpos que puedan interactuar con células efectoras humanas y causar citotoxicidad dependiente de anticuerpos, que se ha demostrado para algunos objetivos.

Aptámeros de ARN a PSMA

Por primera vez desde el desarrollo del método SELEX (evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial) [38] , Shawn et al. . [39] . Desde entonces, estos aptámeros y sus diversas modificaciones se han utilizado para administrar sustancias a las células cancerosas. Además, se optimizaron reduciendo, por ejemplo, la longitud de A10 de 71 a 39 nucleótidos, conservando la especificidad de unión a PSMA, lo que facilitó su síntesis [40] .

Hasta la fecha, se han sintetizado varios conjugados de A9 y A10 con diversas sustancias: A9:rGel (gelonina recombinante, una toxina proteica que escinde la adenina en la posición 4324 del ARNr 28S) [41] , ANp:A9:(CGA)7:Dox (doxorrubicina, se agregaron repeticiones adicionales al aptámero para unir varias moléculas de doxorrubicina, ANp - nanopartículas de oro) [42] , etc. Todos ellos se unen efectivamente al antígeno y posteriormente se internalizan.

También se demostró que el uso de la quimera A10:Plk1 siRNA (Plk1 es una polo quinasa 1, se expresa eficientemente en LNCaP; se demostró que la inhibición de Plk1 induce la apoptosis en células de esta línea celular [43] ) elimina activamente el ARN de Plk1 a través de la interferencia de ARN [43] . Una de las principales ventajas de este enfoque es que es un sistema de un componente, que es relativamente más fácil de sintetizar.

Pronto, se propuso un diseño más complejo, que aumentó significativamente la eficiencia de eliminar el cáncer de próstata. Estos son aptámeros unidos covalentemente al dendrímero, cada uno de los cuales puede transportar una toxina de quimioterapia (por ejemplo, Dox) o ser un agente inmunoestimulador [44] . Esto hace posible administrar simultáneamente una gran cantidad de medicamentos. Además, la unión al dendrímero contribuye a la estabilización de los aptámeros: más de la mitad del conjugado se almacena durante 24 horas en el suero sanguíneo (el conjugado aptámero:toxina se degrada completamente después de 3 horas) [44] .

En comparación con los anticuerpos monoclonales, los aptámeros se pueden modelar y sintetizar fácilmente, siendo más pequeños y menos inmunogénicos, manteniendo una alta especificidad para las células cancerosas diana.

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