Ratón knockout

Un ratón knockout  es un ratón de laboratorio modificado genéticamente en el que uno de los genes se elimina a propósito mediante la eliminación o el reemplazo con una determinada secuencia de nucleótidos . Con su ayuda, es fácil estudiar las funciones de los genes secuenciados cuyas funciones aún no se han determinado. Al interrumpir un gen en particular y examinar las diferencias resultantes del comportamiento o la fisiología normal, los experimentadores pueden intentar determinar su función.

La fisiología humana es similar a la de los ratones, y los científicos pueden usar estos animales para probar tecnologías médicas relacionadas con la fisiología humana, ya que la comunidad científica no acepta el uso de embriones humanos por razones éticas. Por lo tanto, los ratones son actualmente las especies de animales de laboratorio más adecuadas para las que se puede aplicar fácilmente el método de inactivación. El primer ratón knockout fue creado por Mario R. Capecchi , Martin Evans y Oliver Smithies en 1989, por lo que recibieron el Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 . Aspectos de la tecnología del ratón knockout y los propios ratones han sido patentados en muchos países por empresas privadas. La desactivación de genes en ratas de laboratorio es mucho más difícil y solo ha sido posible desde 2003 [1] [2] .

Uso

Desactivar la actividad de un gen proporciona pistas valiosas sobre cómo funciona. Debido a la similitud entre los genes humanos y de ratón, la observación de las características de los ratones knockout proporciona datos para los investigadores. Usando la información, los científicos sacan conclusiones sobre el papel de un gen en el desarrollo de un organismo [3] , en particular, sobre la capacidad de responder a enfermedades en humanos.

Los ejemplos de investigación en los que los ratones knockout han sido útiles incluyen el estudio y modelado de varios tipos de cáncer, obesidad, enfermedades cardíacas, diabetes, artritis, abuso de sustancias, ansiedad, envejecimiento y enfermedad de Parkinson . Los ratones knockout también ofrecen un contexto biológico en el que se pueden desarrollar y probar fármacos y otras terapias.

Procedimiento

“Para obtener ratones knockout, la construcción genéticamente modificada resultante se introduce en células madre embrionarias, donde la construcción se somete a una recombinación somática y reemplaza el gen normal, y las células modificadas se implantan en la cría de nuevas variedades por selección clásica es casi imposible, por lo tanto , en la actualidad, las principales esperanzas están puestas en la ingeniería genética. La eliminación de genes se puede utilizar para estudiar la función de un gen en particular. Este es el nombre que se le da a la técnica de borrar uno o más genes, que permite estudiar las consecuencias de tal mutación. Para el knockout, se sintetiza el mismo gen o el blastocisto de su madre sustituta" [4] .

Esquema de cría para obtener ratones knockout. La creación de ratones comienza en el momento de crear cultivos celulares, introduciendo los cuales se crea el organismo deseado en un embrión joven. Usando el fago lambda o el cósmido, el gen objetivo se extrae de la biblioteca genómica del ratón mediante el método in vivo. En su lugar, se inserta un marcador seleccionable dominante, mientras que el gen objetivo se elimina al mismo tiempo . "Como resultado, se obtiene un (biología molecular) | plásmido híbrido , en el que los segmentos del gen objetivo del ratón (secuencias flanqueantes) se unen al marcador seleccionable a la derecha y a la izquierda. Las células con un gen inactivado se insertan en los blastocitos. Las células madre embrionarias se aíslan del blastocisto de ratón (embrión muy joven) y se cultivan in vitro. Para este ejemplo, tomaremos células madre de ratón blanco. Se inyectan blastocistos que contienen células tanto salvajes como células inactivadas en el útero de la madre adoptiva .Esto da como resultado descendientes o de tipo salvaje, teñidos del mismo color que un donante de blastocisto (gris) o una quimera (mixta) y parcialmente eliminados. Los ratones quimera se cruzan con un ratón normal de tipo salvaje (gris), produciendo descendientes que son ya sea blanco y heterocigoto para el gen inactivado, o gris y de tipo salvaje.Los ratones heterocigotos blancos pueden criarse posteriormente para producir ratones homocigotos para el gen inactivado.

Hay varias variaciones en el procedimiento para obtener ratones knockout; a continuación se muestra un ejemplo típico.

La nueva secuencia del paso 1 se introduce en las células madre del paso 2 mediante electroporación. Como resultado del proceso natural de recombinación homóloga, algunas de las células madre sometidas a electroporación incorporarán la nueva secuencia del gen knockout en sus cromosomas en lugar del gen original. Las posibilidades de un evento de recombinación exitoso son relativamente bajas, por lo que la mayoría de las células alteradas solo tendrán la nueva secuencia en uno de los dos cromosomas correspondientes; se consideran heterocigotas. Las células que se han transformado con un vector que contiene un gen de resistencia a la neomicina y un gen tk+ del herpes se cultivan en una solución que contiene neomicina y ganciclovir para seleccionar las transformaciones que se han producido a través de la recombinación homóloga. Cualquier inserción de ADN que se produzca como resultado de una inserción accidental morirá porque da positivo tanto para el gen de resistencia a la neomicina como para el producto del gen del herpes tk+, cuyo producto genético reacciona con el ganciclovir para formar una toxina mortal. Además, las células que no integran ninguno de los materiales genéticos dan negativo para ambos genes y, por lo tanto, mueren como resultado del envenenamiento con neomicina.

Las células madre embrionarias que incluían el gen knockout se aíslan de las células inalteradas utilizando el gen marcador del paso 1. Por ejemplo, las células inalteradas pueden destruirse con un agente tóxico al que las células alteradas sean resistentes. Las células madre embrionarias knockout del paso 4 se inyectan en un blastocisto de ratón. Para este ejemplo, usamos blastocistos de ratón gris. Los blastocistos ahora contienen dos tipos de células madre: originales (de un ratón gris) y células knockout (de un ratón blanco). Estos blastocistos luego se implantan en el útero de ratones hembra, donde se desarrollan. Por lo tanto, los ratones recién nacidos serán quimeras: algunas partes de sus cuerpos se forman a partir de las células madre originales, otras a partir de células madre eliminadas. Su pelaje mostrará parches blancos y grises, con parches blancos derivados de células madre eliminadas y parches grises del blastocisto receptor. Algunos ratones quimera recién nacidos tendrán gónadas derivadas de células madre inactivadas y, por lo tanto, producirán óvulos o espermatozoides que contienen el gen inactivado. Cuando estos ratones quimera se cruzan con otros ratones de tipo salvaje, algunos de sus descendientes tendrán una copia del gen knockout en todas sus células. Estos ratones no retienen ningún ADN de ratón gris y no son quimeras, sin embargo, siguen siendo heterocigotos. Cuando estos descendientes heterocigotos se entrecruzan, algunos de sus descendientes heredarán el gen knockout de ambos padres; no portan una copia funcional del gen original sin cambios (es decir, son homocigóticos para ese alelo). Una explicación detallada de cómo se crean los ratones knockout (KO) se encuentra en el sitio web del Premio Nobel de Fisiología o Medicina 2007 [5] .

Restricciones

Los Institutos Nacionales de Salud discuten algunas limitaciones importantes de esta técnica [6] .

Como todos los ratones de laboratorio, los ratones knockout no tienen buena inmunidad a las enfermedades naturales. Pero esto se compensa con su alta sensibilidad al patógeno específico para el que fueron creados.

Si bien la tecnología de ratones knockout es una valiosa herramienta de investigación, existen algunas limitaciones importantes. Alrededor del 15 por ciento de los genes desactivados son letales para el desarrollo, lo que significa que los embriones modificados genéticamente no pueden convertirse en ratones adultos. Este problema a menudo se supera con mutaciones condicionales. La falta de ratones adultos limita la investigación al desarrollo embrionario y, a menudo, dificulta determinar la función del gen en relación con la salud humana. En algunos casos, un gen puede desempeñar una función diferente en los adultos que en los embriones en desarrollo.

La eliminación de un gen también puede no resultar en cambios notables en el ratón, o incluso puede resultar en características diferentes a las observadas en humanos que tienen el mismo gen inactivado. Por ejemplo, las mutaciones en el gen p53 están asociadas con más de la mitad de los cánceres humanos y, a menudo, conducen a tumores en un conjunto específico de tejidos. Sin embargo, cuando el gen p53 se elimina en ratones, los animales desarrollan tumores en una matriz de tejido diferente.

Hay variabilidad a lo largo del procedimiento, dependiendo en gran medida de la cepa de la que se obtuvieron las células madre. Por lo general, se utilizan células derivadas de la cepa 129. Esta cepa específica no es adecuada para muchos experimentos (p. ej., conductuales), por lo que es muy común retrocruzar la progenie con otras cepas. Algunos loci genómicos han demostrado ser muy difíciles de identificar. Las razones pueden ser la presencia de secuencias repetitivas, metilación extensa del ADN o heterocromatina. La presencia confusa de 129 genes vecinos en un segmento knockout del material genético se ha denominado "efecto del gen flanqueante". [7] Se han propuesto métodos y directrices para hacer frente a este problema [7] .

Otra limitación es que los ratones knockout normales (es decir, no condicionados) se desarrollan en ausencia del gen en estudio. A veces, la pérdida de actividad durante el desarrollo puede enmascarar el papel de un gen en la edad adulta, especialmente si el gen está involucrado en múltiples procesos que abarcan el desarrollo. Luego, se requieren enfoques de mutación condicional/inducible que primero permitan que el ratón se desarrolle y madure normalmente hasta que se elimine el gen de interés.

Otra limitación importante es la falta de adaptaciones evolutivas en el modelo knockout que pueden ocurrir en animales de tipo salvaje después de su mutación natural. Por ejemplo, la coexpresión específica de eritrocitos de GLUT1 con estomatina es un mecanismo compensatorio en mamíferos que no pueden sintetizar vitamina C [8] .

Notas

1. ↑ Helen R. Pilcher. Es un nocaut   // Naturaleza . - 2003. - doi : 10.1038/noticias030512-17 .
2. ↑ Zan Y, Haag JD, Chen KS, Shepel LA, Wigington D, Wang YR, Hu R, Lopez-Guajardo CC, Brose HL, Porter KI, Leonard RA, Hitt AA, Schommer SL, Elegbede AF, Gould MN. Producción de ratas knockout usando mutagénesis ENU y un ensayo de detección basado en levadura  //  Nature Biotechnology. - 2003. - vol. 21 , edición. 6 _ — pág. 645–51 . -doi : 10.1038/ nbt830 . —PMID 12754522 .
3. ↑ Shchelkunov S. N. Ingeniería genética . - Editorial de la Universidad de Siberia, 2004. - P. 453. (Ruso)
4. ↑ Rizvanova A. Kh. Principios bioéticos e ingeniería genética . - 2013. - S. 2. (Ruso)
5. ↑ Premio Nobel de  Medicina 2007 . premio nobel.org . Consultado el 21 de enero de 2022. Archivado desde el original el 25 de junio de 2018.
6. ↑ Hoja informativa sobre ratones knockout archivada el 16 de diciembre de 2018 en Wayback Machine /Instituto Nacional de Investigación del Genoma Humano
7. ↑ 1 2 Robert Gerlai. Estudios dirigidos a genes del comportamiento de los mamíferos: ¿es la mutación o el genotipo de fondo?  (Inglés)  // Tendencias en Neurociencias. - 1996. - Mayo (vol. 19). - pág. 177-181 . — ISSN 0166-2236 . - doi : 10.1016/S0166-2236(96)20020-7 .
8. ↑ Crusio WE, Goldowitz D., Holmes A., Wolfer D. Normas para la publicación de estudios de ratones mutantes  //  Genes, Brain and Behavior. - 2009. - 28 de enero (vol. 8). - P. 1-4 . — ISSN 1601-1848 . -doi : 10.1111/ j.1601-183X.2008.00438.x .

diccionarios y enciclopedias	Britannica (en línea)