Borrado de puntos

Dot blot  es una técnica utilizada en biología molecular para detectar varias macromoléculas como ácidos nucleicos o proteínas. Esta técnica es una simplificación del Western blot : las muestras que contienen las macromoléculas estudiadas se aplican inmediatamente a una membrana de nitrocelulosa o PVDF, evitando la etapa de electroforesis preliminar en PAAG (en particular, cuando se trabaja con proteínas).

Protocolo para trabajar con membrana PVDF

  1. Aplique las muestras de prueba a la membrana de PVDF seca (1-3 µl de solución por punto). Cuando se trabaja con una membrana de PVDF, el tampón en el que se disuelven las muestras debe tener una fuerza iónica suficientemente alta , de lo contrario, es posible que la solución simplemente no entre en la membrana debido a sus propiedades hidrofóbicas.
  2. La membrana debe secarse. Por lo general, 30 minutos a temperatura ambiente es suficiente.
  3. Coloque la membrana en tampón para reducir los enlaces de anticuerpos no específicos. El papel de un agente que reduce las interacciones no específicas generalmente lo realiza la albúmina de suero bovino (BSA) o la leche en polvo . 20 minutos - 1 hora a temperatura ambiente.
  4. Coloque la membrana en el tampón de anticuerpo primario. BSA o leche en polvo también está presente en este tampón, pero en menor cantidad. 1 hora - ON, T = 4 С°.
  5. Lavar la membrana 3 x 5 min.
  6. Coloque la membrana en un tampón que contenga un anticuerpo secundario que contenga un agente de detección como la peroxidasa de rábano picante . 1-2 horas a temperatura ambiente.
  7. Lavar la membrana de nuevo durante 3 x 5 min.
  8. Coloque la membrana en la solución de detección. Es mejor agregar peróxido de hidrógeno al 30% a una solución comercial (alrededor de 10-50 µl por 10 ml de solución). 1-3 minutos a temperatura ambiente.
  9. Detección. En el caso de utilizar anticuerpos secundarios con peroxidasa de rábano picante, se observa radiación quimioluminiscente provocada por el corte del sustrato de la solución de detección con peroxidasa de rábano picante. En el caso de utilizar un dispositivo que registre quimioluminiscencia, una exposición muy pequeña (hasta 2 minutos) es suficiente

Véase también