Análisis inmunocromatográfico

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El análisis inmunocromatográfico (IHA)  ( ing.  Prueba de flujo lateral ) es un método de análisis inmunoquímico basado en el principio de la cromatografía en capa fina e incluye la reacción entre un antígeno y su anticuerpo correspondiente en materiales biológicos. Se lleva a cabo utilizando tiras reactivas especiales, paneles o casetes de prueba.

Esencia del método

El principio de funcionamiento es que cuando una tira reactiva se sumerge en un fluido biológico (u otra muestra líquida), comienza a migrar a lo largo de la tira según el principio de la cromatografía en capa fina. Junto con él, se mueven los anticuerpos específicos marcados aplicados en la parte inferior de la tira reactiva, que se unen por afinidad al analito.

Hay 2 formas de ICA: método directo y competitivo.

  1. El esquema ICA directo (sándwich) utiliza un conjugado de anticuerpo-marca aplicado a la membrana conjugada. En la línea de prueba, se inmovilizaron anticuerpos específicos para este analito, y en la línea de control, se inmovilizaron anticuerpos anti-especie específicos para los anticuerpos primarios. Cuando se aplica una muestra que contiene un analito, cuando la muestra golpea la membrana con el conjugado, el analito se une al conjugado de etiqueta At. Luego, el complejo inmunitario ingresa a la zona de prueba, donde se une a anticuerpos específicos, formando un "sándwich" de la etiqueta Ab-Ag-Ab. El exceso de conjugado no unido se une a los anticuerpos anti-especie en la línea de control. Por lo tanto, la detección de 2 líneas en la tira reactiva es un resultado positivo de la prueba. En ausencia de un analito en la muestra, el conjugado se une a los anticuerpos anti-especie solo en la línea de control, formando una sola línea en la tira reactiva. El método ICA directo se utiliza para detectar compuestos macromoleculares: virus, incluido el VIH; varias hormonas (por ejemplo, en pruebas de embarazo), patógenos de enfermedades infecciosas.
  2. El método ICA competitivo utilizado para la determinación de compuestos de bajo peso molecular se basa en la competencia entre el analito y el conjugado inmovilizado de analito:proteína transportadora por un número limitado de sitios de unión de anticuerpos específicos contenidos en el conjugado At-tag. Cuando se aplica una muestra que contiene un analito, se une al conjugado At-tag en la membrana con el conjugado. A continuación, el inmunocomplejo pasa a través de la zona de prueba, donde se inmoviliza el conjugado analito:proteína transportadora. El inmunocomplejo no puede unirse a este conjugado debido al impedimento estérico: los compuestos de bajo peso molecular suelen tener un determinante antigénico y, en consecuencia, los anticuerpos tienen un sitio de unión para un antígeno que ya es un analito ocupado. A continuación, el complejo inmunitario se une a los anticuerpos anti-especie que se encuentran en la línea de control. Como resultado, la ausencia de una banda de color en la zona de prueba y la presencia de color en la zona de control indica que la concentración del analito en la muestra de prueba supera su valor umbral para esta prueba.

En ausencia de un analito en la muestra, el conjugado At-tag se une al conjugado Ag:proteína transportadora inmovilizado en la zona de la línea de prueba. El conjugado At-tag no unido entra en la zona de la línea de control y se une allí con anticuerpos anti-especie. Por lo tanto, la presencia de dos líneas de color (prueba y control) es un resultado negativo del análisis.

Se utiliza una forma de ICA competitiva para detectar compuestos de bajo peso molecular, incluidos metabolitos de compuestos narcóticos en orina, fluidos orales y extractos de tejidos.

La ventaja del método es su velocidad y facilidad de uso, la posibilidad de utilizar formularios ICA no instrumentales con una evaluación visual del resultado del análisis. En este caso, no se requiere equipo y el análisis puede ser realizado por un no especialista en cualquier condición, incluido el "campo".

También existen formas semicuantitativas y cuantitativas instrumentales de ICA, que utilizan lectores especiales para registrar la intensidad de la etiqueta en la zona de prueba de la tira reactiva.

Etiquetas utilizadas en IHA

Varias partículas se utilizan como etiquetas en ICA, que tienen las siguientes propiedades:

  1. Agentes colorantes (nanopartículas de oro coloidal o carbón, o partículas de látex coloreado). En este caso se utiliza la detección visual del resultado, o determinación colorimétrica instrumental (o escaneo). El uso de etiquetas de diferentes colores adheridas a las partículas de látex permite un análisis múltiple en el que las líneas de diferentes colores corresponden a diferentes analitos. La etiqueta más utilizada es nanopartículas de oro coloidal.
  2. Etiquetas fluorescentes, fosforescentes y bioluminiscentes unidas covalentemente a partículas de látex. Estas etiquetas se usan solo en versiones instrumentales del ICA, cuando el resultado es registrado por un lector especial (sensor). Entre los anteriores, las etiquetas fluorescentes son las más comunes.
  3. Etiquetas paramagnéticas (también adheridas a partículas de látex). Este tipo de marcas se utiliza en ICA con el uso de dispositivos que registran la fuerza del campo magnético.
  4. Las etiquetas de enzimas se usan de la misma manera que en ELISA. La reacción enzimática se registra tiñendo los sustratos y el resultado del análisis es visual o leído por un sensor.
  5. Una nueva dirección en el desarrollo de varios tipos de ICA es el uso de liposomas como portadores de varios tipos de marcadores (colorantes, fluorescentes, enzimáticos, electroactivos, etc.).

Literatura

Enlaces