Coomassie
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Coomassie Brilliant Blue es el nombre de dos tintes de trifenilmetano estrechamente relacionados desarrollados para la industria textil, pero ahora ampliamente utilizados en bioquímica analítica para colorear proteínas. Coomassie Brilliant Blue G-250 se diferencia del R-250 por tener dos grupos metilo. El nombre "Coomassie" es una marca registrada de Imperial Chemical Industries .
Nombre e historia del descubrimiento
El nombre Coomassie se registró a finales del siglo XIX como marca comercial de Blackley Company para tintes de lana. [1] En 1896, durante la Cuarta Guerra Anglo-Ashanti , las tropas británicas ocuparon la ciudad de Coomassie (ahora Kumasi en Ghana ). En 1918, Levinstein Ltd, propietaria de la marca comercial Coomassie, pasó a formar parte de British Dyestuffs, que pasó a manos de Imperial Chemical Industries en 1926. [2] Imperial Chemical Industries actualmente no produce tintes, pero sigue siendo el propietario de la marca comercial Coomassie.
Los tintes azules a base de derivados azufrados del trifenilmetano fueron obtenidos por primera vez en 1913 por Max Weiler, quien trabajaba en la ciudad de Wuppertal (Alemania). [3] [4] [5] [6]
Los artículos en revistas bioquímicas a menudo no explican exactamente qué tinte "Coomassie" se utilizó. La lista de colores de en:Color Index International contiene más de 40 tintes que contienen el término "Coomassie" en el nombre. Merck Index (10ª edición) Coomassie Blue RL (Acid Blue 92, CI 13390) tiene una estructura completamente diferente.
Color de tinte
El sufijo "R" en el nombre del tinte Coomassie Brilliant Blue R-250 es una abreviatura de la palabra Red (rojo), ya que el color azul del tinte tiene un ligero tinte rojizo. La variante de tinte con el sufijo "G" tiene un ligero tinte verdoso. Los números "250" denotaban la pureza del tinte.
El color de los tintes depende de la acidez del medio. El tinte "G" ha sido estudiado en detalle. [7] A pH por debajo de 0, el tinte tiene un color rojo y un máximo de absorción a una longitud de 470 nm. A un pH de aproximadamente 1, el colorante es verde y el máximo de absorción es de 620 nm. Por encima de pH 2, el colorante es azul brillante con un máximo de absorción de 595. A pH 7, el colorante tiene un coeficiente de extinción molar de 43.000 M- 1 cm - 1 . [7]
Un cambio en el color de la solución corresponde a un cambio en la carga de la molécula de colorante. En la forma roja, los tres átomos de nitrógeno están cargados positivamente. Los dos residuos de ácido sulfúrico tienen un pKa muy bajo y , por lo tanto, suelen estar cargados negativamente, por lo que a un pH cercano a cero, el colorante es un catión con una carga neta de +1. El color verde corresponde a una molécula sin carga. A pH 7, solo el átomo de nitrógeno en la difenilamina tiene una carga positiva, por lo que la molécula en su conjunto es un anión con una carga total de -1. Los valores de pKa necesarios para perder dos protones son 1,15 y 1,82. El último protón se desprende en medio alcalino y la molécula adquiere un color rosa ( pK a 12,4). [7]
Los tintes forman un complejo con detergentes aniónicos, como el laurilsulfato de sodio . [8] La formación de dicho complejo estabiliza el color verde de la forma neutra del tinte. Este efecto puede afectar la determinación de la concentración utilizando el método de Bradford . Es probable que los detergentes aniónicos compitan con el colorante por la unión a proteínas.
Uso en bioquímica
Coomassie Brilliant Blue R-250 se utilizó para teñir proteínas en 1964 [9] . Las muestras de proteínas se separaron por electroforesis en una hoja de acetato de celulosa . La hoja se colocó en ácido sulfosalicílico para fijar las proteínas y luego se transfirió a la solución de colorante.
En 1965, Coomassie Brilliant Blue R-250 se usó para teñir proteínas después de la separación electroforética en gel de poliacrilamida [10] . El gel se colocó en una solución colorante que contenía metanol, ácido acético y agua. Después de la tinción de proteínas, el gel de poliacrilamida (PAAG) tuvo que lavarse electroforéticamente. Se demostró además que el gel se puede lavar con una solución de ácido acético.
El colorante "G" se utilizó por primera vez para visualizar proteínas en un gel de poliacrilamida en 1967 , cuando el colorante se disolvió en una solución de ácido acético con metanol [11] .
Posteriormente se demostró que las bandas de proteínas se pueden teñir sin colorante coloidal "G", en solución de ácido tricloroacético sin metanol. El uso de este protocolo no requiere el lavado del gel [12] .
Los protocolos modernos utilizan la forma coloidal del tinte "G" en una solución que contiene ácido fosfórico, etanol (o metanol) y sulfato de amonio [13] [14] [15] [16] .
El método de Bradford utiliza las propiedades espectrales de Coomassie Brilliant Blue G-250 para determinar la cantidad de proteína en solución [17] . Para ello, se añade a la muestra de proteína una solución colorante en ácido fosfórico y etanol. En condiciones ácidas, el tinte es marrón, pero cuando se une a la proteína, se vuelve azul. La absorción óptica de la solución se mide a una longitud de onda de 595 nm.
La unión de una proteína a un Coomassie Brilliant Blue G-250 cargado negativamente imparte una carga negativa a la proteína, que se puede usar para separar mezclas de proteínas en PAAG en condiciones no desnaturalizantes usando el método Blue Native PAGE [18] [19] .
La movilidad del complejo en un gel de poliacrilamida depende del tamaño de la proteína, del complejo proteico y de la cantidad de colorante unido a la proteína.
Véase también
Notas
- ↑ Fox, MR Dye-makers of Great Britain 1856-1976: A History of Chemists, Companies, Products and Changes . - Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. - Pág. 38.
- ↑ Fox, MR Dye-makers of Great Britain 1856-1976: A History of Chemists, Companies, Products and Changes . - Manchester: Imperial Chemical Industries, 1987. - Pág. 259.
- ↑ Índice de color (indefinido) . — 3er. - Bradford: Sociedad de Tintoreros y Coloristas, 1971. - V. 4. - S. 4397-4398. Copia archivada (enlace no disponible) . Fecha de acceso: 27 de mayo de 2013. Archivado desde el original el 19 de julio de 2011.
- ↑ , "Procédé de production de colorants de la série du triarylméthane", Patente FR 474260 , emitida el 16 de febrero de 1915
- ↑ Weiler, Max, "Tinte de trifenilmetano azul", patente de EE. UU. 1218232 , emitida el 6 de marzo de 1917
- ↑ , "Fabricación de colorantes de triarilmetano", patente GB 275609 , emitida el 3 de noviembre de 1927
- ↑ 1 2 3 Chial, HJ; Thompson, HB; Splittgerber, AG Un estudio espectral de las formas de carga de Coomassie Blue G // Bioquímica analítica : diario. - 1993. - vol. 209 , núm. 2 . - pág. 258-266 . -doi : 10.1006 / abio.1993.1117 . —PMID 7682385 .
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Literatura
- Gessner, T. & Mayer, U. (2002), Tintes de triarilmetano y diarilmetano , Enciclopedia de química industrial de Ullmann, sexta edición , Weinheim: Wiley-VCH , DOI 10.1002/14356007.a27_179