Método del cometa de ADN

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Cinco tipos condicionales de cometas de ADN que se tienen en cuenta al analizar el grado de daño del ADN

El método del cometa de ADN es un método para detectar daños en el ADN y estudiar la reparación a nivel de células individuales. El método es capaz de detectar roturas de cadenas de ADN en células individuales. Es rápido y muy sensible [1] .

Historia

El trabajo de Rydberg y Johanson (1978) [2] se considera la primera experiencia exitosa en el estudio del daño del ADN en células individuales . Posteriormente, el método se modificó y mejoró repetidamente para simplificarlo y aumentar la sensibilidad para detectar daños en el ADN celular [2] .

Aplicabilidad

El método del cometa de ADN es aplicable tanto en sistemas in vivo como in vitro . Actualmente, el método es ampliamente utilizado en estudios de genotoxicidad por radiación ionizante , productos farmacéuticos y químicos industriales, reparación de ADN, apoptosis, estudios clínicos sobre diagnóstico prenatal, susceptibilidad al cáncer, terapia contra el cáncer, cataratas. Este método se está convirtiendo gradualmente en una parte integral de los programas de biomonitoreo:

evaluación de la influencia de la dieta, factores ambientales, cambios en el metabolismo y el estado fisiológico, envejecimiento del cuerpo en la acumulación y reparación del daño del ADN;
estudiar los mecanismos de los efectos radioprotectores, la formación de una respuesta radioadaptativa;
investigación ambiental.

El uso del método permite tener en cuenta la heterogeneidad de poblaciones complejas, para estudiar el rendimiento del daño y la reparación del ADN en casi todas las células eucariotas. Al mismo tiempo, solo se necesitan unos pocos miles de células de la muestra de prueba para el análisis [1] [3] .

Declaración de método

La inmovilización de las células expuestas al factor en estudio se lleva a cabo en agarosa de bajo punto de fusión depositada en un portaobjetos de vidrio para microscopía. El tratamiento de muestras en un tampón con alto contenido de sal conduce a la lisis de las membranas celulares y la extracción de proteínas. Las moléculas de ADN se separan mediante electroforesis, las huellas de ADN se visualizan tiñéndolas con un tinte fluorescente, después de lo cual las muestras se examinan microscópicamente. En presencia de roturas de ADN, se altera la organización estructural de la cromatina y se pierde el superenrollamiento del ADN , lo que conduce a la relajación de esta biomacromolécula, y se forman fragmentos de ADN que no están asociados a la célula. En un campo eléctrico, los bucles relajados y los fragmentos de ADN se estiran hacia el ánodo, lo que da a los objetos observados la apariencia de "cometas" (de ahí el nombre de " ensayo cometa ", que se ha vuelto de uso común). La cantidad de ADN que migra hacia el ánodo y determinada por un microfotómetro se puede utilizar como indicador que caracteriza el nivel de daño del ADN en las células estudiadas. Los "cometas" se analizan mediante observación visual y diferenciación de "cometas" según el grado de daño en el ADN, o mediante el uso de software de procesamiento de imágenes por computadora. El último método de análisis de "cometas" es especialmente necesario para una evaluación objetiva del efecto de una pequeña concentración de un agente dañino, o para identificar diferencias menores entre subpoblaciones celulares [1] .

Estandarización de métodos

Actualmente, la mayoría de los laboratorios que han implementado este enfoque metodológico en la investigación han desarrollado numerosas variaciones del protocolo, en particular, la duración y las condiciones de lisis celular, desnaturalización, electroforesis y tinción de ADN. Se cuentan 25-500 células en un vaso por duplicado. Los resultados del experimento son confiables cuando se repiten al menos 6 veces. El análisis de los cometas de ADN se puede realizar visualmente o utilizando un complejo de software y hardware. En el análisis visual, los cometas de ADN se clasifican en cinco tipos condicionales con el valor numérico correspondiente de 0 a 4.

Cálculo de índices

Designacion	Característica	Cálculo
${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}$	Índice de cometa de ADN (índice de cometa de ADN) ${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}$ — Grado de daño en el ADN El índice de cometas de ADN se calcula como la relación entre la suma de los "cometas de ADN" de cada tipo y la suma total de los "cometas de ADN" contados.	${\mathsf {\mbox{I}}}_{{\mbox{dc}}}={\frac {(0{\mbox{n}}_{0}+1{\mbox{n}}_{ 1}+2{\mbox{n}}_{2}+3{\mbox{n}}_{3}+4{\mbox{n}}_{4})}\Sigma}$ , donde es el número de “cometas de ADN” de cada tipo, y ${\mbox{n}_0 - \mbox{n}_4}$ ${\Sigma}$ - la suma de los "cometas de ADN" contados.

Programas de imagen y análisis

CometScore es un programa gratuito para el cálculo semiautomático de puntuaciones de cometas de ADN, compatible con Windows 5 y 6.
CaspLab - Software GPL.
Programa comercial : listado por Comet Assay Interest Group

Véase también

Notas

↑ 1 2 3 Sorochinskaya, Mikhailenko, 2008 , p. 303-309.
↑ 1 2 Rydberg B, Johanson KJ. Estimación de roturas de cadenas de ADN en células de mamíferos individuales // Academic Press. - Nueva York, 1978. - S. 465-468 .
↑ S. Cotelle y JF Ferard. Ensayo de cometa en ecotoxicología genética: una revisión // Mutagénesis ambiental y molecular. - Wiley-Liss, 1999. - T. 34 . - S.: 246-25 . Archivado desde el original el 4 de marzo de 2016.

Literatura

La exposición a largo plazo a factores ambientales adversos se acompaña de acumulación de daño en el ADN y cambios en la actividad del sistema de reparación, lo que puede conducir a mutaciones y transformación maligna de la célula. En los últimos años, se han desarrollado muchos métodos para detectar daños en el ADN y estudiar los procesos de reparación. Sin embargo, no todos tienen la sensibilidad y especificidad necesarias para monitorear una amplia gama de daños ambientales al ADN. El objetivo de la revisión es evaluar la eficacia del método de electroforesis en gel de células individuales lisadas (método ADN cometa) para la detección de daños en el ADN causados por diversos agentes ambientales. El método tiene la sensibilidad necesaria para detectar el daño y la reparación del ADN a nivel de una célula individual y puede utilizarse para evaluar la integridad integral del genoma.
W. B. Sorochinska, V.M. Mijailenko. Aplicación del método cometa de ADN para evaluar el daño en el ADN causado por diversos agentes ambientales // ONCOLOGÍA: Artículo. - Kiev, 2008. - T. 10 , no. 3 . - S. 303-309 . Archivado desde el original el 5 de marzo de 2016. (Ruso)
Avishai, Nanthawan; Rabinowitz, Claudette; Moiseeva, Elisabeth y Rinkevich, Baruch. Genotoxicidad del río Kishon: la aplicación de un ensayo celular in vitro : resumen en HTML. - Israel: Mutation Research, 2002. - Vol. 1 , no. 518 . — P. 21–37 . - doi : 10.1016/S1383-5718(02)00069-4 .
Collins, AR; Dobson, VL; Dusinska, M.; Kennedy, G. & Stetina, R. El ensayo del cometa: ¿qué nos puede decir realmente? // Investigación de mutaciones: resumen HTML. - 1997. - Vol. 2 , número. 375 . - S. 183-193 . - doi : 10.1016/S0027-5107(97)00013-4 .
Claudio, M.; Erikson, S.; Nygren, J. & Ahnstrom, G. El ensayo del cometa: mecanismos y consideraciones técnicas. - Mutation Research, 1996. - Vol. 2 , no. 363 . - S. 89-96 . - doi : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 .
McKelvey-Martin, Valerie J.; Ho, Edwin T.; McKeown, Stephanie R.; Johnston, S.Robin; McCarthy, Patsy J.; Rajab, Nor Fasilah y Downes, C. Stephen. Aplicaciones emergentes del ensayo de electroforesis en gel de una sola célula (Comet). I. Manejo del carcinoma invasivo de vejiga humana de células transicionales. II. Cometas de hibridación fluorescente in situ para la identificación de secuencias de ADN dañadas y reparadas en células individuales : texto completo en PDF. - Mutagénesis, 1993. - T. 1 , no. 13 _ - S. 1-8 . - doi : 10.1016/0921-8777(95)00063-1 .
Olive, PL; Wlodek, D. & Banath, JP Roturas de doble cadena de ADN medidas en células individuales sometidas a electroforesis en gel // Cancer Research: texto completo en PDF. - 1991. - T. 17 , núm. 51 . - S. 4671-4676 .
Rojas, E.; Lopez, MC & Valverde, M. Electroforesis en gel unicelular: metodología y aplicaciones // Journal of Chromatography B : HTML abstract. - 1999. - T. 722 (1-2) . - S. 225-254 . - doi : 10.1016/S0378-4347(98)00313-2 .
Singh, NP; McCoy, MT; Tice, RR & Schneider, EL Una técnica simple para la cuantificación de bajos niveles de daño en el ADN en células individuales // Experimental Cell Research. - 1988. - T. 175 (1) . - S. 184-191 . - doi : 10.1016/0014-4827(88)90265-0 .