Prueba de alio

La prueba Allium  es un sistema de prueba de plantas para evaluar los efectos mutagénicos , modificadores de la mitosis y tóxicos de factores químicos y físicos basados ​​en la planta de cebolla Allium cepa ( variedad Stuttgarten ).

La prueba Allium utiliza las raíces de las plántulas de cebolla Allium cepa , que fue propuesta por primera vez por la Real Academia Sueca de Ciencias como un objeto de prueba estándar [1] [2] .

En la investigación moderna, Allium cepa L. se considera un objeto de prueba de planta de referencia para el análisis de mutagenicidad, mitotoxicidad y toxicidad de varios factores [1] [3] . Junto con la prueba de Allium, también se utilizan otros objetos de prueba (entre las plantas, las más comunes son los guisantes Pisum sativum y las habas Vicia faba ).

Este método es lo suficientemente simple, económico, rápido y sensible para determinar si un factor es " mutágeno " o "no mutágeno", "citotóxico" o "no citotóxico". [4] . La prueba Allium se recomienda para el estudio de casi todos los factores químicos, físicos y biológicos. A medida que se sintetizan nuevas sustancias, la prueba recibe nuevas recomendaciones, lo que la convierte en una de las más populares.

La prueba Allium es recomendada por los expertos de la OMS como estándar en el monitoreo citogenético del medio ambiente, ya que los resultados obtenidos en esta prueba muestran una correlación con las pruebas en otros organismos: algas, plantas, insectos, incluidos mamíferos y humanos [2] [5] [6] [7] [8] . Recomendado como alternativa a los ensayos genotoxicológicos en animales de laboratorio (en caso de que para las mismas sustancias de ensayo se observe el mismo resultado en este ensayo y en los ensayos con animales, es decir, si se demuestra una correlación) [9]

Historia del método

La historia del biotest Allium test comenzó hace más de 70 años. El autor de la metodología es el académico de la Real Academia Sueca de Ciencias, Dr. Albert Levan (1905–1998). Conocido por su trabajo en citogenética, genotoxicología, oncogenética y también por el hecho de que en 1956, junto con Joe Hin Tio, determinó el conjunto de cromosomas humanos [10] .

Albert Levan fue a la creación de la prueba Allium gradualmente. En 1929-1937 Levan estudió la morfología y el conjunto de cromosomas en varios representantes del género Allium [11] [12] . Al mismo tiempo, se guió por los trabajos de muchos científicos destacados: Edward Regel, Eduard Strasburger, Heinrich Schaffner [13] [14] , Georg Tischler, Emil Heitz, Edmund Wilson, Mikhail and Sergey Navashin, Grigory Levitsky y muchos otros. . Basándose en su trabajo y en su propio trabajo, Albert Levan concluyó que A. cepa es un objeto ideal para estudios citogenéticos detallados. La razón principal por la que se hizo la elección es que la especie tiene una "excelente condición cromosómica" [15] . Los bulbos germinan rápidamente y están disponibles durante todo el año. Eligió los meristemos de la raíz para estudiar la mitosis [16] .

En 1937 se publicó en la revista Science un sensacional artículo de A. F. Blacksley y A. G. Avery sobre un nuevo método que permite obtener valiosas plantas poliploides tras el tratamiento de semillas con colchicina [17] . En el mismo año, el trabajo de B. R. Nebel, quien independientemente llegó a las mismas conclusiones, fue publicado en la revista Nature [18] .

En 1938, Albert Levan, desarrollando sus ideas, realiza su propia investigación. En varias series de experimentos, actuó con colchicina en los meristemos de la raíz de A. cepa y registró la mitosis: las células aumentaron significativamente de tamaño y la cantidad de cromosomas se multiplicó. La manifestación visual de la mitosis que observó fue un engrosamiento "similar a un tumor" de las puntas de las raíces [12] . En 1945, Levan publicó un artículo en la revista Nature en el que demuestra que las sales de 25 metales son capaces de inducir varios tipos de aberraciones cromosómicas en los meristemos de la raíz de A. cepa. Estudió el efecto de la exposición al acenaftol, cloroformo, ácido naftaleno acético y muchos otros compuestos. En 1949, Albert Levan escribe sobre un nuevo método en citogenética y le da el nombre de prueba de Allium. Una versión temprana del método incluía solo el análisis de la mitosis en las profases. En un trabajo posterior, Albert Levan comenzó a registrar fragmentos y puentes, y los destacó como una categoría separada de "efectos radiomiméticos" [15] [19] . Levan creía que los resultados obtenidos en la prueba Allium son un indicador importante para una investigación más profunda sobre la mutagénesis y la carcinogénesis [15] .

Junto con Levan, a otros científicos se les ocurrió la idea de crear el método de prueba Allium de manera similar. En 1941, Karl Sachs de la Universidad de Harvard estudió el efecto de los rayos X en los meristemos de la raíz de A. cepa y registró varias anomalías cromosómicas [20] . En 1948, Francisco D'Amato de la Universidad de Pisa descubrió que varios compuestos químicos tenían un efecto mitotóxico. D'Amato desarrolló la "prueba de plántulas de cebolla" y, junto con sus colegas, investigó los efectos citogenéticos de más de 40 sustancias químicas [21] . En el mismo año, se publicó un artículo de Leon Vanderlin (1948), quien escribe sobre las mitosis en los meristemos de la raíz de A. cepa como un modelo clásico de mitosis en citogenética [22] .

En 1973, la Real Academia Sueca de Ciencias recomendó la prueba de Allium como la prueba de detección estándar. Las razones de ello fueron su rapidez, economía y facilidad de ejecución, así como el “excelente estado de los cromosomas” en A. cepa L. Según W. Grant, para 1982 se estudió el potencial genotóxico de más de 148 compuestos químicos. utilizando el método de prueba Allium. Con base en esto, V. Grant concluye que es necesario incluir la prueba de Allium en la lista de pruebas genéticas y toxicológicas estándar, que fue realizada por expertos de la OMS en 1985 [23]

En 1979-1985. G. Fiskesjo, alumno de A. Levan, desarrolla y adapta un método para evaluar varios compuestos químicos. Presta gran atención no solo a dar cuenta de la frecuencia de las aberraciones cromosómicas, sino también a medir la longitud de las raíces, como indicador del efecto tóxico del factor en estudio, que está directamente relacionado con los microparámetros. Fiskesjo señala que la sensibilidad de la prueba Allium es prácticamente la misma que la sensibilidad de la prueba en linfocitos humanos [2] . Aquí está su propia evaluación de este método:

J. Rank y M.G. Nelson (1993) propuso una modificación del análisis de antelofase, que identifica tres tipos de anomalías cromosómicas: fragmentos, puentes y retraso cromosómico. Los autores recomendaron usar bulbos de A. cepa variedad Stuttgarten-Riesen [24] . J. Rank (2003) muestra una correlación del 82 % entre la sensibilidad de la prueba Allium y la prueba de roedores a los productos químicos (en particular, pesticidas). También señala que la sensibilidad de la prueba de Allium en el estudio de aguas residuales es mayor que en la prueba de Ames [25] .

En 1995 T.-H. Ma propuso una modificación en la que se estimaba el efecto mutagénico teniendo en cuenta la frecuencia de los micronúcleos [26] . D. M. Leme y M. A. Marin Morales (2008) propusieron un análisis conjunto de aberraciones cromosómicas y micronúcleos como un indicador esencial del efecto directo de un factor químico en el ADN [27] . Un método similar fue propuesto en 2013 por D.S. Pesnya y A.V. Romanovsky para evaluar los efectos genotóxicos y citotóxicos de la radiación electromagnética [28] . La estandarización estadística de la prueba de Allium fue realizada por A. Barberio et al. (2011). Analizaron más de 50 estudios que se realizaron utilizando la metodología de prueba Allium. Con base en el análisis de estos datos, los autores recomendaron para cada serie de experimentos usar una muestra de 3 bulbos, 3 raíces de cada uno [29] .

El uso de la versión "moderna" de la prueba Allium en combinación con el método cometa de ADN para evaluar el daño genético es cada vez más popular. El método fue propuesto en 1997 por Navarrete et al .[30] . Posteriormente, se comprobó que en la prueba de Allium, la sensibilidad del método cometa de ADN, el análisis de antelofase y la prueba de micronúcleos es la misma, ya que dan un resultado positivo al probar las mismas sustancias [31] [32] . Se recomienda el uso del método cometa de ADN en la prueba Allium para evaluar el potencial genotóxico de mutágenos directos e indirectos [33] .

Actualmente, el término Allium test se utiliza junto con un número cada vez mayor de objetos y, al mismo tiempo, sigue siendo uno de los mejores objetos de prueba para el análisis de la genotoxicidad de varios factores.

Beneficios

Ventajas del sistema de ensayo en plantas Allium cepa . Ventajas de la prueba Allium sobre otros métodos

Este método no requiere conocimiento del cariotipo e identificación de tipos de daño cromosómico, es lo suficientemente simple, económico y sensible para determinar el factor "mutágeno" o "no mutágeno" [4] .

El método permite registrar mutaciones cromosómicas como deleciones y translocaciones, que resultan en la presencia de puentes y fragmentos en la anafase y telofase . El método permite detectar cambios en el comportamiento de los cromosomas en el huso de división [4] . La prueba Allium es ideal para la prueba de micronúcleos.

Ventajas de los sistemas de ensayo en hortalizas sobre el ejemplo de la cebolla Allium cepa

Los sistemas de prueba de plantas se están volviendo más comunes en la evaluación de la contaminación mutagénica del medio ambiente . Esto se debe a una serie de ventajas de las plantas como indicadores de genotoxicidad de diversos factores, así como objetos de señal en el seguimiento genético del estado del medio ambiente:

Características de la cebolla Allium cepa L., aplicabilidad en ensayos

Allium cepa L. (División Angiospermae , clase Liliopsida , subclase Lilidae , orden Liliales , familia Alliaceae , género Allium L. ) como objeto de prueba es ampliamente utilizado para evaluar el potencial genético[ término desconocido ] compuestos químicos, aguas naturales y residuales [3] . Las cebollas tienen 16 cromosomas bien teñidos (2n=16) [38] . La duración del ciclo celular es de aproximadamente 17,8 horas [41] . El índice mitótico puede fluctuar en diferentes raíces de la misma planta, pero los datos promediados son bastante estables. La duración de la mitosis en diferentes tejidos radiculares de Allium cepa es la misma y no cambia a lo largo de la raíz. La relación de las diferentes fases de la mitosis no depende del tiempo de fijación.

Las pruebas que utilizan tejidos meristemáticos de plántulas de raíz de cebolla permiten registrar efectos tóxicos (crecimiento de raíces), modificadores de la mitosis (actividad mitótica alterada del meristema, patología del huso ) y mutagénicos (inducción de micronúcleos y mutaciones cromosómicas) [3] .

El análisis más utilizado de la frecuencia de aberraciones cromosómicas en la ana - telofase de la mitosis (prueba de antelofase) . Esta prueba registra mutaciones cromosómicas como deleciones y translocaciones, así como violaciones del huso de división en términos de frecuencia de retraso cromosómico, mitosis multipolar y asimétrica. El método de la ana-telofase que utiliza una cebolla como objeto de prueba se recomienda como objeto de prueba para entornos naturales. Al comparar la actividad mutagénica de los contaminantes químicos determinada en otras pruebas toxicogenéticas con el método de antelofase, se encontró que su sensibilidad es alta y asciende al 82%.

Sin embargo, tener en cuenta solo las aberraciones cromosómicas puede conducir a una subestimación del efecto genotóxico real, por ejemplo, por las siguientes razones. Primero, estos métodos no permiten el registro de mutaciones genéticas que ocurren con mucha más frecuencia que las cromosómicas. En segundo lugar, las mutaciones cromosómicas se detectan, por regla general, en el contexto de una alta actividad mitótica de las células meristemáticas. El aumento de la toxicidad de los factores ambientales puede causar una disminución en el número de células en división debido a un retraso en el ciclo celular en los puntos de control, o la muerte de algunas células, por lo tanto, la frecuencia del daño cromosómico registrado también disminuirá artificialmente.

Los puntos de control del ciclo celular (checkpoints) son períodos del ciclo en los que se comprueba la precisión de la etapa anterior. Este mecanismo protege a las células en división de la mitosis letal al detener la división y dar tiempo para que el sistema de reparación repare el daño del ADN. Cuando el mecanismo de control detecta ADN dañado o no replicado, se produce un retraso en el ciclo celular durante el cual tiene lugar el ajuste. Los puntos de control son las transiciones G1-S y G2 - M. También hay un punto específico de control en la transición de la metafase a la anafase . Un aumento en el número de trastornos bajo la influencia de genotóxicos conduce a un retraso en el ciclo celular en los puntos de control, lo que afecta el número de células en división y la duración de las fases del ciclo celular.

En consecuencia, para reducir posibles respuestas falsas negativas en la detección de factores genotóxicos y cancerígenos, es conveniente utilizar como indicador la actividad modificadora de la mitosis del factor estudiado, que viene determinada por el nivel de actividad mitótica del tejido y la duración relativa de las fases de mitosis. El estudio de la actividad modificadora de la mitosis permite identificar cambios tempranos en el sistema citogenético del cuerpo causados ​​​​por un complejo de diversos trastornos.

El efecto modificador de la mitosis en el meristema de la raíz de la planta se estudia en paralelo con la determinación de la frecuencia de las aberraciones cromosómicas. En consecuencia, una amplia gama de trastornos de estructuras genéticas y procesos genéticos pueden registrarse en una sola prueba, lo que simplifica el estudio y reduce el costo de su implementación [42] .

Por lo tanto, el uso de un sistema de prueba de plantas permite no solo decir sobre el impacto cuantitativo del factor estudiado en un objeto vivo, sino también determinar la naturaleza del impacto en las áreas afectadas del material genético.

Los factores de diversa naturaleza son adecuados para la prueba (ver tabla):

Factor físico:
  • Radiación. En la década de 1950, Karl Sachs demostró que los rayos X podían inducir una gran cantidad de mutaciones cromosómicas en las células de la punta de la raíz de las cebollas. Se conocen los trabajos de Grodzinsky , quien demostró en la prueba de Allium que el nivel de radiación en la zona de exclusión de Chernobyl es suficiente para la aparición de trastornos genéticos y se observará un aumento del nivel de trastornos durante varias generaciones después de la exposición (radiación ionizante) [ 20] [28] [43]
  • Radiación ultravioleta
  • Infrarrojos :
    • La temperatura
  • Emisión de radio (radiación no ionizante):
    • Radiación UHF. En particular, la radiación de la gama GSM de teléfonos móviles. Se ha demostrado que la radiación de los teléfonos móviles ordinarios (modo conversación) con una exposición prolongada (1-3 horas) es capaz de provocar mutaciones cromosómicas en una cantidad comparable a la provocada por una exposición de 20 minutos al plutonio-239[ aclarar ] . Efectos similares fueron causados ​​por la radiación de 400 y 900 MHz creada por dispositivos emuladores. La prueba de Allium se recomienda como método citogenético para evaluar los efectos de la radiación de radiofrecuencia [28] [44] [45] [46] [47]
 En el caso de un factor mutagénico físico, los bulbos se exponen al factor con otras condiciones ambientales idénticas, como en el control.
Factor químico:
  • Varios compuestos químicos o soluciones de sustancias [48] [49] .
    • Soluciones de varias sales. En 1945, Albert Levan publicó un artículo en Nature sobre los efectos genotóxicos del litio, berilio, sodio, potasio, cromo, hierro, cobalto, níquel, cobre, arsénico, rubidio, itrio, paladio, cadmio, bario, lantano, neodimio, erbio. , sales de cerio , oro, mercurio, talio, plomo, bismuto y torio [19]
    • Se ha propuesto la prueba Allium para probar varias nanopartículas. [50] [51] ,
    • Productos farmacéuticos y drogas [9] [52] [53]
      (por ejemplo, talidomida ) [54]
    • Algunos tintes [55]
    • pesticida [7]
  • Entornos naturales y antropogénicos:
    • Aguas naturales: ríos, lagos [29]
    • Emisiones industriales/aguas residuales [56]
    • Aguas de mina, ecosistemas perturbados en sitios mineros [57]
 En el caso de un factor mutagénico químico, los bulbos se germinan en una solución o una solución concentrada de un químico y agua en una concentración conocida. El control se germina en agua sin la adición de un factor químico mutagénico.
Factor biológico:
  • Productos de desecho de organismos.
    • Biotoxinas (p. ej., ocratoxina A, producida por algunos mohos) [58]
    • Hormonas [59] [60]
    • Se recomienda la prueba Allium para el biomonitoreo de masas de agua durante la "floración" de las algas verdeazuladas [61]
 Similar al anterior

Metodología de prueba

Preparación de equipos para pruebas

Equipos y materiales

Placas de Petri, probetas graduadas (25 y 100 ml), frascos de penicilina o recipientes similares de fondo profundo de 20 ml, portaobjetos y cubreobjetos de vidrio, frascos (15, 25 y 100 ml), pipetas graduadas (1,0; 2,0; 10,0), pipetas oculares, lupas estereoscópicas MBS-9, microscopios [62] .

Reactivos químicos
Acetoorceína
2% 		Se disuelven 2 g de horceína en 100 ml de ácido acético caliente al 45%, se hierve en secreto (no se permite la ebullición) y se filtra. Se utiliza para colorear espinas.
Retenedor Clark una mezcla de alcohol etílico al 96% y ácido acético glacial en una proporción de 3:1. Se utiliza para fijar las raíces.
Alcohol
70% 		una mezcla de alcohol etílico al 96% y agua destilada. Se utiliza para el almacenamiento a largo plazo
Ácido acético
40-45% 		una mezcla de ácido acético glacial y agua destilada. Se utiliza para preparar medicamentos.

Preparación de material

Preparación de bulbos

Seleccionar bombillas para la investigación. La muestra debe ser homogénea tanto en el control como en las variantes experimentales del experimento. El peso medio del conjunto es de 10-20 g, con un diámetro de 1,5-2 cm Los bulbos seleccionados no deben secarse en exceso. Esto se puede entender quitando la cáscara extra que, además, puede interferir con el experimento. Antes del inicio del experimento, los bulbos no deberían haber brotado brotes verdes de hojas.

Procedimiento de prueba y preparación del factor de mutagénesis

Hay dos variantes de la prueba Allium: original y modificada:

  • En la versión original de la prueba, los bulbos se colocan en agua limpia para que germinen raíces (nota: el autor permite el uso de agua del grifo. Debe tenerse en cuenta que en Suecia, de donde proviene el autor, el agua del grifo es realmente muy limpio. Alternativamente, puede usar agua potable purificada de baja salinidad). Cuando las raíces alcanzan 1-2 cm, los bulbos se transfieren a recipientes con la solución de prueba durante un cierto tiempo (de 2 horas en el caso de una solución de colchicina a 3 días). La versión original es más conveniente cuando se prueban factores físicos.
  • En una versión modificada de la prueba, los bulbos se colocan directamente en la solución de prueba sin germinación previa de las raíces. Esta opción se usa más comúnmente en las pruebas de productos químicos [62] .

Para la pureza del experimento, está permitido usar agua destilada. En este caso, el bulbo crecerá debido a las reservas internas de nutrientes durante todo el experimento sin experimentar depresión. En experimentos donde se investigan sustancias químicamente activas, es preferible utilizar agua destilada para evitar la formación de otros compuestos. La limitación aquí es que el agua destilada es fisiológicamente defectuosa y en otras pruebas su uso es difícil. Sin embargo, tanto en el control como en el experimento, en este caso, se considerará igual el daño por agua destilada, así como otras condiciones de fondo.
Los bulbos germinan en 3 a 4 días. Es recomendable utilizar recipientes de 1,5 cm de diámetro y 10 cm de altura, para que a medida que crecen, las raíces no se apoyen contra el fondo del recipiente en el que se encuentran. De lo contrario, puede provocar algunos efectos biológicos: la reacción del meristema ante un obstáculo. Para realizar un análisis de antelofase, se toma una parte de la columna vertebral de aproximadamente 1 cm de largo y se lleva a cabo el procedimiento de fijación (para almacenamiento a largo plazo). Si es necesario, las raíces se lavan del fijador en agua y luego se tiñen con acetorceína de acuerdo con el método estándar. Para microscopía, se usa una punta de raíz de 1-2 mm de largo, una zona de división activa de células meristemáticas.

Procesamiento del material después del experimento Fijación

Para la fijación, las raíces se colocan en recipientes con fijador de Clark (ver arriba). Los contenedores se cierran herméticamente y se dejan fijar las células durante 1-2 días. Luego, el material se lava dos veces del fijador en alcohol al 70% y se coloca en recipientes con alcohol al 70% para almacenamiento a largo plazo. El alcohol debe exceder el volumen del material en 4-5 veces. [63] [64] [65]

Coloración de materiales

Las raíces se tiñen con acetoorceína al 2% (ver arriba). Las raíces se lavan del alcohol en agua (convenientemente en placas de Petri). El material se transfiere a pequeños crisoles de porcelana con un soporte, que se llenan con 2/3 de colorante. El crisol se cubre con un portaobjetos de vidrio. Calentado sobre una llama de alcoholes hasta que hierva en secreto (empañamiento de un cubreobjetos). Se deja el crisol con el material durante algún tiempo para teñir los cromosomas (de 2 horas a 1 día). Después de eso, se pueden preparar preparaciones para microscopía. [66]

Método de preparación de preparaciones para análisis microscópico

Prepare preparaciones trituradas temporales de meristemas de raíces. Para hacer esto, la punta del meristema de 2-3 mm de largo se corta de la raíz teñida con una cuchilla (la punta difiere en color más oscuro y engrosamiento), se coloca en un portaobjetos de vidrio en una gota de ácido acético al 45%, se cubre con un cubreobjetos y se tritura suavemente con un fósforo para obtener una monocapa de células. Las preparaciones se analizan al microscopio con un aumento de 12,5x1,5x40. En las preparaciones, se consideran pequeñas células redondas cuadradas con núcleos bien teñidos y paredes celulares intactas. [63]

Prueba de detección

Antes del análisis genético, se debe realizar una prueba de detección inicial, que mostrará de inmediato si el factor tiene una actividad biológica pronunciada. El principal y más importante macroparámetro estudiado es el crecimiento de las raíces. Pero además de ello, también se pueden estudiar otros parámetros:

  • Turgencia. La dureza de las puntas de las raíces está relacionada con el grado de toxicidad del factor. Con una alta toxicidad del factor, la turgencia disminuye, lo que puede conducir a la muerte de las raíces.
  • Cambio de color. Durante el experimento, el color de las cortezas puede cambiar y la razón de esto es el contenido de ciertas sales en el agua (por ejemplo, azul verdoso del sulfato de cobre). Además, las puntas de las raíces pueden volverse marrones, lo que se asocia con el efecto tóxico de un factor que provoca la muerte celular.

Los siguientes parámetros se examinan como estándar:

  • Forma de raíz. La hinchazón de las puntas de las raíces después de 4 a 5 días de exposición indica un tipo especial de trastorno de c-mitosis. La flexión de las raíces o de sus puntas suele ocurrir después de la exposición a soluciones de ciertas sales.
  • Longitud de la raíz. Este es el valor de la longitud promedio de las raíces (para 1 bulbo).
Método para medir la longitud de las raíces

La longitud de la raíz se puede medir de dos maneras:

  • Por lo general, la longitud del sistema de raíces se mide fuera del contenedor con una cinta métrica (medida para cada bulbo). Esto registra la longitud máxima de la raíz alcanzada (excluyendo las raíces más cortas) para cada bulbo. Luego se calcula el promedio para toda la muestra de bulbos (de 3 a 5 piezas) en el experimento. Este método permite tomar medidas durante el experimento.
  • El segundo método es más preciso. Al final del experimento, se cortan las raíces en la base del bulbo, se mide la longitud de cada raíz y se calcula el valor promedio (el valor promedio de cada bulbo). Las raíces dañadas no se tienen en cuenta. Luego se establece el valor promedio de la longitud de las raíces para toda la muestra de bulbos.
Cálculo del parámetro de crecimiento de raíces

Se puede hacer de dos formas:

  • La longitud promedio de las raíces se calcula para cada bulbo en la serie de experimentos experimentales y de control. Luego se calcula el valor promedio total de la longitud para la serie experimental y el control. Se calcula cuantas veces la longitud de las raíces en la serie experimental es mayor/menor que en el control y se expresa en porcentaje. El procesamiento estadístico de los resultados se lleva a cabo mediante análisis de varianza y/o prueba t de Student .
  • Es posible calcular el promedio de una vez como un todo para cada variante del experimento (es decir, sin calcular el valor promedio para una bombilla en particular, ya que todo el grupo de bombillas estaba en condiciones homogéneas). Para comparar las muestras totales para el experimento y el control, puede utilizar el análisis de varianza y la prueba t de Student.

El cambio en la longitud de la raíz en la prueba Allium es un indicador de toxicidad. Este es un indicador muy sensible que se registra fácilmente visualmente y no requiere reactivos ni equipos especiales, se correlaciona bien con los parámetros microscópicos y, por lo tanto, se propone como una prueba de detección a corto plazo. Si hay una inhibición significativa del crecimiento de la raíz en comparación con el control, se observa el efecto tóxico del factor de influencia. En el caso de un aumento significativo de raíces, hablan de un efecto estimulante.

Exámenes microscópicos y procesamiento estadístico

Cálculo de la tasa de mutación

En la prueba de Allium, el método de análisis ana-telofase de la frecuencia de las aberraciones cromosómicas se utiliza tradicionalmente para calcular la frecuencia de las mutaciones. En la etapa de antelofase , se registran mutaciones asociadas con una violación grave de la estructura de los cromosomas, así como con daños en el huso mitótico (huso) o un cambio en el comportamiento de los cromosomas en el huso [67] :

  • cromosomas rezagados,
  • mitosis aberrantes:
    • mitosis tripolares,
    • mitosis cuadripolares,
    • mitosis asimétricas (asimétricas) [38] .
Recomendaciones

A la hora de evaluar la actividad mutagénica de los productos químicos, basta con utilizar únicamente el análisis de antelofase , es decir, registrar mutaciones en las fases de la mitosis, ya que los meristemas están en contacto con el factor de influencia durante todo el experimento. Pero al estudiar la actividad mutagénica de EMR, esta resultó ser insuficiente, ya que los meristemos de la raíz están expuestos a la radiación solo por un cierto período de tiempo. En los intervalos entre las irradiaciones tiene lugar la transformación de los fragmentos cromosómicos inducidos en la anafase y la telofase: las células abandonan la mitosis y pasan a la interfase, y los fragmentos se convierten en micronúcleos. Como resultado, estas mutaciones permanecen desconocidas. En este sentido, se propuso una modificación del método de prueba Allium, que permite tener en cuenta la suma total de mutaciones. En una preparación, se recomendó utilizar análisis de antelofase y prueba de micronúcleos. En este caso, se analiza todo el conjunto de celdas (divisoras y no divisorias), lo que evita respuestas falsas negativas y brinda resultados más confiables [45] .

Cálculo de índices mitóticos y de fase

El cálculo de los índices mitóticos se puede realizar sobre las mismas preparaciones que el análisis de antelofase . Visto de 400 a 600 celdas (más - mejor). Se cuenta el número total de células en división y células individuales en diferentes etapas de la mitosis .

Designación de fase / índice Característica Cálculo del índice
/ MI IM, % — índice mitótico El índice mitótico  es el porcentaje de células en división del número total de células analizadas.


, donde (P+M+A+T)  es la suma de células en las etapas de profase , metafase , anafase y telofase , y N  es el número total de células analizadas.

P / PI [68]

profase ( profase )

PI, %  - índice de profase Índice de profase  : el porcentaje de células en la profase de la mitosis del número total de células analizadas


, donde (P+M+A+T)  es la suma de células en las etapas de profase , metafase , anafase y telofase , y P  es el número de profases en las células calculadas

M / MI [68]

metafase ( metafase )

MI, %  — índice de metafase Índice de metafase  : el porcentaje de células en la metafase de la mitosis del número total de células analizadas


, donde (P+M+A+T)  es la suma de células en las etapas de profase , metafase , anafase y telofase , y M  es el número de metafases en las células calculadas

A / IA

anafase ( anafase )

IA, %  — índice de anafase Índice de anafase  : el porcentaje de células en la anafase de la mitosis del número total de células analizadas


, donde (P + M + A + T)  es la suma de células en las etapas de profase , metafase , anafase y telofase , y A  es el número de anafase en las células calculadas

T / TI

telofase ( telofase )

TI, %  — índice de telofase Índice de telofase  : el porcentaje de células en la telofase de la mitosis del número total de células analizadas


, donde (P+M+A+T)  es la suma de células en las etapas de profase , metafase , anafase y telofase , y T  es el número de telofases en las células calculadas

A-T / A-TI

ana-telofase

A-TI, % — índice de  anatelofase El índice de anatelofase  es el porcentaje de células en anafase y telofase de la mitosis del número total de células analizadas


, donde (P + M + A + T)  es la suma de células en la etapa de profase , metafase , anafase y telofase , y A + T  es el número de anafase y telofase en las células calculadas

Procesamiento estadístico de datos

Métodos estadísticos

Promedio

Cada lomo es una variante. Si la opción es inferior a 30, debe utilizar el método directo: se suman todas las opciones y la cantidad resultante se divide por el número de opciones:

, donde Σ X  es la suma de las variantes, n  es en adelante el número de variantes analizadas (raíces, preparaciones microscópicas).

Los datos integrales obtenidos sobre los índices de fase se someten a procesamiento estadístico. El procesamiento se lleva a cabo de acuerdo con fórmulas para muestras pequeñas (ver media aritmética) .

Desviación estándar σ

Para muestras pequeñas, σ se calcula mediante la fórmula:

La desviación estándar (σ) se caracteriza por una variedad de características. Tiene en cuenta la desviación de la media aritmética de cada opción. Por lo tanto, σ es el mejor indicador de la diversidad de rasgos.

Error promedio para estimar la confiabilidad de la media aritmética

Para muestras pequeñas:

, donde m  es el error de la media, σ es la desviación estándar

Los promedios aritméticos que caracterizan el efecto de la sustancia estudiada sobre la actividad mitótica de las células del meristemo de Allium cepa se calcularon para un pequeño número de repeticiones. La confianza para toda la población se establece utilizando el error medio ( m ).

El valor del error promedio está inversamente relacionado con n. Así, cuantas más repeticiones del experimento se investiguen, menor será el error X. El valor de X debe escribirse con el valor de su error:

Designacion Ejemplo Vista de gráfico
5±0.5%
Número de grados de libertad

Encontrar el indicador de la confiabilidad de la diferencia se lleva a cabo en varias etapas. Se calcula el número de grados de libertad .

prueba t de Student
, donde X 0  es la media aritmética de la variante experimental, X k  es la media aritmética de la variante de control, S d  es el error de desviación, que se determina en n 1 n 2

A continuación, debe comparar los valores medios aritméticos calculados del índice (indicador) de las opciones de control y experimental. X de dos grupos comparados, incluso tomados de la misma población general, siempre pueden diferir entre sí en cierta medida. Por qué averiguamos si las diferencias entre las medias aritméticas de las opciones control y experimental son significativas, o si esta diferencia es accidental. Para aclarar la pregunta, puede usar la prueba t de Student .

Error de desviación para n 1 ≠ n 2si norte 1 = norte 2

Más detalles en el manual. [69]

Programa-métodos estadísticos

Se lleva a cabo utilizando paquetes matemáticos ( Statistica , MS Excel , LibreOffice Calc , etc. ). Para el análisis estadístico de los datos obtenidos por el método de prueba Allium (frecuencia de aberraciones cromosómicas y micronúcleos , índices de fase , etc.), se puede utilizar una hoja de cálculo de autocálculo compatible con MS Excel o LO Calc .

La tabla tiene la capacidad de agrupar datos de manera efectiva en una hoja, proporcionando datos de salida en una forma conveniente para su posterior procesamiento y uso, así como en el futuro para aumentar la funcionalidad de la tabla para tareas específicas o al expandir los parámetros de prueba calculados [ 70] .

Véase también

Notas

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 Organismos modelo en la investigación biológica