Nanoscopia de fluorescencia

La nanoscopia de fluorescencia es un método  para detectar objetos fluorescentes mediante un microscopio óptico , que tiene una resolución espacial varias veces superior al límite teórico de la difracción óptica (~200 nm).

Descripción

En los últimos años, se han desarrollado varios enfoques nuevos en el campo de la microscopía de fluorescencia, que han permitido superar la barrera de difracción de la resolución óptica y lograr una resolución sin precedentes de ~10 nm. Estos métodos comenzaron a unirse bajo el término general de nanoscopia de fluorescencia.

Los sistemas de nanoscopia fluorescente se basan en tres enfoques fundamentalmente diferentes:

• mejora del enfoque debido a la creación de nuevos esquemas ópticos y al uso de lentes con una gran apertura angular (microscopía 4Pi, I5M e I5S);
• uso del fenómeno de reflexión interna total (microscopía de fluorescencia de reflexión interna total, TIRFM);
• "encendido" y "apagado" controlado de moléculas fluorescentes y su detección secuencial ( STED , GSD, SPEM ( SSIM ), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT).

Se pueden prever varias aplicaciones de técnicas nanoscópicas fluorescentes en biología y medicina. La nanoscopia le permite estudiar directamente las interacciones entre las proteínas , el ADN y el ARN y, por lo tanto, puede desempeñar un papel importante en el desarrollo de la genómica y la proteómica , en el estudio de la fisiología celular, en la comprensión de los mecanismos fisiopatológicos asociados con la formación deficiente de complejos complejos proteicos, etc. [1 ]

Estos enfoques se analizan con más detalle a continuación:

• 4Pi e I5M se implementan sobre la base de un sistema de dos objetivos, que mejora la resolución a lo largo del eje óptico hasta 80 nm debido a la suma de dos frentes de luz esféricos opuestos en el punto focal. I5S ha mejorado la resolución en el plano focal (hasta 100 nm).
• TIRFM permite detectar objetos fluorescentes en una capa límite de ~100 nm de espesor con una resolución de hasta 10 nm.
• STED, GSD, SPEM (SSIM), RESOLFT, (F)PALM, STORM, PAINT. La absorción de un cuanto de luz por una molécula va acompañada de la transición de un electrón desde el nivel de energía fundamental (S 0 ) a un nivel fluorescente excitado (singlete S 1 o triplete T 1 ). La absorción también puede inducir reordenamientos intramoleculares reversibles (por ejemplo, isomerización cis-trans ), que dan como resultado un cambio en el espectro de fluorescencia . Cualquiera de las transiciones S 0 →S 1 , S 0 →T 1 se puede utilizar para activar/desactivar los fluoróforos y aumentar la resolución.

Por lo tanto, la microscopía de agotamiento de emisión estimulada (STED) se basa en el uso simultáneo de dos haces de luz: un haz enfocado que excita un fluoróforo en la zona central (S 0 → S 1 ), y un haz que tiene la forma de bagel y extingue fluoróforos alrededor de la zona central (S 1 → S 0 ). Por lo tanto, la fluorescencia se registra solo desde el orificio de la rosquilla. La resolución del método está determinada por la ley donde I s es la potencia de radiación requerida para asegurar la transición preferencial S 1 → S 0 ; I max es la potencia de radiación extintora. Así, la resolución resulta ser ajustable (dependiendo de la potencia de la fuente) y teóricamente infinita (a I max /I s → ∞). En la práctica, se ha alcanzado un umbral de ~10 nm, que corresponde a la dimensión de las macromoléculas biológicas .

La microscopía de iluminación estructurada saturada (SSIM) o la microscopía de excitación de patrón saturado (SPEM) se basa en un principio similar . La microscopía de agotamiento del estado fundamental (GSD) implementa un principio similar, pero extingue el estado excitado mediante la transición de la molécula a un estado T 1 de mayor duración . Finalmente, la microscopía de transición fluorescente óptica saturable reversible (RESOLFT ), la microscopía de localización de fotoactivación (PALM) y la microscopía de reconstrucción óptica estocástica (STORM ) se basan en encender/apagar los fluoróforos debido a su isomerización fotoquímica .

El análisis de la ubicación de los fluoróforos en el espacio 3D se lleva a cabo mediante estos métodos de diferentes maneras. STED, GSD, SPEM/SSIM y RESOLFT usan enfoque óptico para registrar secuencialmente una señal a partir de coordenadas espaciales dadas; PALM y STORM apagan los fluoróforos aleatoriamente y simultáneamente acumulan señales de fluoróforos encendidos ubicados a una distancia de .

Notas

1. ↑ Peters R. De la nanoscopia de fluorescencia a la medicina nanoscópica // Nanomedicina. V. 3, 2008. P. 1–4.

Literatura

• Infierno SW Nanoscopia óptica de campo lejano // Ciencia. 2007. V. 316. P. 1153–1158.

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