La electroforesis en gel de agarosa de ADN es un método analítico utilizado para separar fragmentos de ADN por longitud. Se basa en la diferente velocidad de movimiento de fragmentos de diferentes longitudes al moverse en el gel bajo la acción de un campo eléctrico externo .
Una de las aplicaciones del método es el estudio del ADN plasmídico . Por lo general, es anular y forma estructuras secundarias, como enrollarse en una superespira . Así, para determinar el tamaño del plásmido, es necesario destruir los elementos de la estructura secundaria. Para ello, antes de aplicarlo al gel, el plásmido se “linealiza” (se hace lineal), es decir, se trata con una de las enzimas de restricción (endonucleasas). La enzima de restricción se elige de modo que corte el plásmido en un solo lugar.
Para separar fragmentos de ADN de diferentes longitudes se utiliza un gel con diferentes concentraciones de agarosa. Cuanto menor sea la longitud de los fragmentos de ADN a separar, mayor deberá ser la concentración de agarosa:
| Longitud de los fragmentos de ADN a separar, pb |
Concentración de agarosa , % |
|---|---|
| 50-1500 | 2 |
| 300-3000 | 1.5 |
| 400-6000 | 1.2 |
| 500-10000 | una |
| 800-10000 | 0.7 |
| 1000-20000 | 0.5 |
Durante la electroforesis, los fragmentos de ADN migran en el gel bajo la influencia de las fuerzas del campo eléctrico . El hecho es que el esqueleto de azúcar-fosfato de las moléculas de ADN está cargado negativamente y, por lo tanto, las cadenas de ADN se mueven desde el cátodo cargado negativamente hasta el ánodo positivo . Las moléculas más largas migran más lentamente mientras permanecen en el gel, las moléculas más cortas se mueven más rápido.
Antes de comenzar la electroforesis, se acostumbra agregar dos colorantes diferentes con un pH ácido a las muestras (a menudo se usa azul de xileno y azul de bromofenol para este propósito ) para visualizar el progreso de la electroforesis y pesar las muestras con glicerol (hasta 20% de glicerol). en la muestra). El tinte también es necesario para determinar cuándo detener el proceso.
La electroforesis se lleva a cabo en una cámara llena de una solución tampón . Los tampones más utilizados contienen EDTA , Tris y ácido bórico o acético. En consecuencia, el tampón que contiene ácido bórico se denomina TBE (tris-borato-EDTA) y el tampón que contiene ácido acético se denomina TAE (tris-acetato-EDTA). Las concentraciones de las aguas madres de TBE y TAE son 6x y 50x, respectivamente, en comparación con sus concentraciones de trabajo. El tampón es necesario para aumentar la fuerza iónica de la solución en la que se producirá la separación de las moléculas de ADN bajo la acción de un campo eléctrico aplicado.
Después de la separación (a veces, el tinte se agrega a la agarosa fundida), los fragmentos de ADN de diferentes longitudes se visualizan utilizando tintes fluorescentes que interactúan específicamente con el ADN, por ejemplo, los geles de agarosa generalmente se tiñen con bromuro de etidio , que se intercala entre las bases nitrogenadas del dúplex. y fluorescencia en los rayos UV .
El dimensionamiento se realiza comparando conjuntos de fragmentos comerciales de ADN de longitud conocida ("escalera de ADN", "regla", "marcadores de ADN") y el ADN en las muestras analizadas. Normalmente, el contenido de fragmentos individuales también se indica en marcadores comerciales, de modo que, comparando la intensidad de las bandas, es posible evaluar rápidamente la concentración de ADN en las muestras analizadas. Si es necesario, los marcadores de ADN para el gel se pueden hacer de forma independiente tratando el plásmido con una enzima de restricción, que lo corta en varios lugares. Para esto, se selecciona una endonucleasa, bajo cuya acción se forman 5-6 fragmentos de varias longitudes.
Por lo general, los geles de agarosa se usan para el análisis electroforético del ADN, pero si los fragmentos de ADN que se van a separar tienen solo unas pocas decenas de pares de bases, entonces se puede usar un gel de poliacrilamida . El gel de poliacrilamida también se usa para moléculas cortas de ADN de alta resolución en la secuenciación de ADN .