Electroforesis capilar

La electroforesis capilar , también conocida como electroforesis zonal capilar ( CZE ), se utiliza para separar iones por carga . En el caso de la electroforesis convencional, las moléculas cargadas se mueven en un líquido conductor bajo la influencia de un campo eléctrico . En la década de 1960, se propuso una técnica de electroforesis capilar para separar moléculas por carga y tamaño en un capilar delgado lleno de electrolito .

Equipamiento

La electroforesis capilar requiere un equipo relativamente simple. El esquema del experimento se muestra en la Figura 1 . Los componentes principales del sistema son el vial de aplicación, el vial de inicio, el vial final, el capilar, los electrodos, la fuente de alta potencia, el detector y el dispositivo de procesamiento de datos. La botella de aplicación de muestra, la botella de inicio y la botella final se llenan con un electrolito, como una solución tampón acuosa. Para aplicar la muestra, el extremo del capilar se sumerge en el vial de la muestra y luego se transfiere al vial inicial. El movimiento de las sustancias analizadas se realiza bajo la acción de un campo eléctrico. Todos los iones se mueven a lo largo del capilar en una dirección bajo la influencia de la corriente electroosmótica. Los analitos se separan por movilidad electroforética y se detectan cerca del final del capilar. [una]

Detección

La detección de moléculas separadas durante la electroforesis capilar puede llevarse a cabo mediante varios dispositivos. Los dispositivos más comunes detectan cambios en la absorción de radiación en la región ultravioleta o en la región de luz visible. Típicamente, en tales sistemas, una parte de un capilar se usa como celda. La longitud del camino de la luz transmitida en la electroforesis capilar es del orden de 50 micrómetros, que es mucho menor que en el caso de las células ultravioleta convencionales, en las que la longitud del camino de la luz es del orden de 1 centímetro.

Según la ley de Bouguer-Lambert-Beer, la sensibilidad de un detector es proporcional a la longitud del camino que recorre la luz a través de la celda. Para aumentar la sensibilidad, se alarga el camino por el que viaja la luz, pero a medida que aumenta el tamaño de la celda, la resolución disminuye. El tubo capilar se puede expandir en el sitio de detección, este tipo se llama celda de burbuja. En otra opción, se logra un aumento en el camino de la luz transmitida agregando un capilar adicional (ver Figura 2 ). Ambos métodos reducen la eficacia de la separación. [2]

La detección de fluorescencia se puede utilizar en electroforesis capilar de muestras naturalmente fluorescentes o modificaciones químicas que introducen etiquetas fluorescentes. Este método de detección proporciona una alta sensibilidad, pero no se puede utilizar para detectar muestras no fluorescentes. También se utiliza la detección de fluorescencia inducida por láser, tales sistemas de electroforesis capilar pueden detectar en el rango de 10-18 - 10-21 mol.

Para distinguir muestras similares, los sistemas de separación por electroforesis capilar se pueden conectar directamente a los espectrómetros de masas. En la mayoría de estos sistemas, el extremo del capilar se coloca en un aparato de ionización por electroaerosol . Las partículas ionizadas se analizan más a fondo mediante espectrometría de masas. [2]

Métodos de separación

Las moléculas se separan mediante electroforesis capilar debido a las diferencias de movilidad en un campo eléctrico aplicado. La velocidad de movimiento ( ) de las moléculas separadas en el campo aplicado en relación con el electrodo con la carga opuesta: ${\ estilo de visualización u_ {p}}$

$u_{p}=\mu _{p}E$

donde es la movilidad electroforética y E es la fuerza del campo eléctrico. La movilidad electroforética es proporcional a la carga del ion. En el caso de que la muestra consista en dos tipos de moléculas que difieren en carga, la separación se produce como resultado de la electroforesis. La movilidad electroforética de una sustancia a valores de pH dados es: $\mu _{p}$

$\mu _{p}={\frac {z}{6\pi \eta r))$

donde es la carga específica de la molécula y es el radio de Stokes de la molécula: ${\ estilo de visualización {z))$ $r$

$r={\frac {k_{B}T}{6\pi \eta \D}}$

donde es la constante de Boltzmann y la temperatura, y D es el coeficiente de difusión . Estas ecuaciones muestran que la movilidad electroforética de una molécula es proporcional a la carga e inversamente proporcional a su radio. La movilidad electroforética se puede determinar experimentalmente a partir del tiempo de movimiento de una molécula en un campo eléctrico de una fuerza dada: $k_B$ $T$

$\mu _{p}=\left({\frac {L}{t_{r}}}\right)\left({\frac {L_{t}}{V}}\right)$

donde es la distancia desde el punto de partida hasta el sitio de detección, es el tiempo que tarda la molécula analizada en llegar al punto de detección, es la intensidad del campo eléctrico y es la longitud total del capilar. [2] Dado que el campo eléctrico actúa solo sobre moléculas cargadas, las moléculas sin carga se separan débilmente mediante electroforesis capilar. $L$ $t_{r}$ $V$ ${\ Displaystyle L_ {t}}$

La velocidad de movimiento de las moléculas analizadas durante la electroforesis capilar depende de la magnitud del flujo electroosmótico en el tampón. En general, el flujo electroosmótico se dirige hacia el cátodo cargado negativamente. A diferencia de las movilidades electroforéticas, las moléculas se mueven hacia el electrodo de carga opuesta. [1] Las partículas con carga negativa se mueven hacia el ánodo con carga positiva, las partículas con carga positiva se mueven hacia el cátodo en la dirección del flujo electroosmótico (consulte la Figura 3 ).

El caudal electroosmótico se puede representar como: $tu_{o}$

$u_{o}=\mu _{o}E$

donde la movilidad electroosmótica es igual a: ${\ estilo de visualización \ mu _ {o}}$

$\mu _{o}={\frac {\epsilon \zeta }{\eta }}$

donde es el potencial de la pared del capilar y es la permitividad relativa de la solución amortiguadora. La movilidad electroosmótica se puede determinar midiendo el tiempo de retraso de las moléculas con carga neutra. [2] La velocidad de movimiento ( ) de la molécula analizada en un campo eléctrico se puede representar como: $\zeta$ $\epsilon$ $tu$

$u_{p}+u_{o}=(\mu _{p}+\mu _{o})E$

Debido al hecho de que el flujo electroosmótico de la solución tampón suele ser mayor que el flujo electroforético de las sustancias analizadas, todas las moléculas analizadas se mueven con la solución tampón hacia el cátodo. Las moléculas con carga negativa permanecen más tiempo en el capilar debido a las contradicciones en sus movilidades electroforéticas. [1] El orden de movimiento de las moléculas cargadas se muestra en la Figura 3 : los cationes pequeños se mueven rápidamente, los aniones pequeños con carga múltiple se retrasan fuertemente. [2]

Eficiencia y resolución

El número de platos teóricos, o eficiencia de separación en el caso de electroforesis capilar, viene dado por la ecuación:

${\ Displaystyle N = {\ frac {\ mu V} {2D_ {m}}}}$

donde es el número de platos teóricos, es la movilidad aparente en el medio de separación y es el coeficiente de difusión de la sustancia a separar. De acuerdo con esta ecuación, la eficiencia de separación está limitada solo por la difusión y es proporcional a la fuerza del campo eléctrico. La eficiencia de separación por electroforesis capilar es generalmente mucho mayor que la de otros métodos de separación, como la cromatografía líquida de alta resolución . A diferencia de la HPLC, en el caso de la electroforesis capilar no hay transferencia de masa entre fases. [2] El perfil de flujo en el caso de los sistemas de flujo electroosmótico es plano, en contraste con el perfil laminar de las columnas cromatográficas en las que la separación se produce bajo presión (consulte la Figura 5 ). Como resultado, durante la separación electroosmótica no se produce la expansión de la banda, como ocurre en la cromatografía. La separación por electroforesis capilar puede tener varios cientos de miles de platos teóricos. [3] $norte$ $\mu$ ${\ Displaystyle D_ {m}}$

La resolución ( ) de la separación por electroforesis capilar se puede escribir como: $R_{s}$

$R_{s}={\frac {1}{4))\left({\frac {\triangle \mu _{p}{\sqrt {N))}{\mu _{p}+\ mu _{o}}}\derecho)$

De acuerdo con esta ecuación, la resolución máxima se alcanza a valores similares de movilidad electroforética y electroosmótica, pero con signo opuesto. Además, la alta resolución requiere baja velocidad y, en consecuencia, requiere más tiempo de separación. [2]

Métodos relacionados

La separación por electroforesis capilar se basa en las diferencias en las movilidades electroforéticas de las moléculas a separar. Sin embargo, algunas clases de moléculas no se pueden separar porque no tienen carga o difieren ligeramente en la movilidad electroforética. Para separar los componentes neutros (sin carga) de la muestra, se utiliza la cromatografía electrocinética micelar (MEKC) , en la que se agregan tensioactivos a la solución tampón para formar micelas . Los polímeros cargados, como el ADN, se pueden separar en capilares llenos de gel; el gel ralentiza las moléculas más largas más que las más cortas. Esta variante de la electroforesis capilar se denomina electroforesis en gel capilar. Algunos sistemas de electroforesis capilar se pueden utilizar para la cromatografía a microescala. También se pueden utilizar sistemas de electroforesis capilar para isotacoforesis , isoelectroenfoque y electroforesis de afinidad .

Notas

↑ 1 2 3 4 Skoog, DA; Holler, FJ; Crouch, S. R. "Principios de análisis instrumental" 6ª ed. Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ 1 2 3 4 5 6 7 Skoog, DA; Holler, FJ; Crouch, S. R. "Principios de análisis instrumental" 6ª ed. Capítulo 30 Thomson Brooks/Cole Publishing: Belmont, CA 2007 .
↑ Skoog, DA; Holler, FJ; Nieman, TA "Principios de análisis instrumental, 5ª ed." Saunders College Publishing: Filadelfia, 1998 .

Literatura

Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. quimica _ 1984 , 56 , 111.
Terabe, S.; Otsuka, K.; Ichikawa, K.; Tsuchiya, A.; Ando, T. Anal. quimica _ 1984 , 56 , 113.
Foley, JP Anal. quimica _ 1990 , 62 , 1302.
Carretero, AS; Cruces-Blanco, C.; Ramírez, SC; Pancorbo, AC; Gutiérrez, A. F. J. Agric. alimento. quimica _ 2004 , 52 , 5791.
Cavazza, A.; Corradini, C.; Laura, A.; Nicoletti, I. J. Agric. química alimentaria 2000 , 48 , 3324.
Rodrigues, MRA; Caramao, EB; Arce, L.; Ríos, A.; Valcárcel, M. J. Agric. química alimentaria 2002 , 50 , 4215.

Véase también

electroforesis

Enlaces

Animación de electroforesis capilar
Electroforesis capilar para expertos y principiantes . Archivado el 4 de mayo de 2015 en Wayback Machine .