La secuenciación de iones semiconductores ( eng. Ion Semiconductor Sequencing ) es un método para determinar la secuencia de ADN basado en la detección de iones de hidrógeno que se liberan durante la polimerización del ADN. Esta es una técnica de "secuenciación en la síntesis" en la que se construye una hebra complementaria a partir de la secuencia de una hebra molde.
Los micropocillos que contienen la molécula de ADN molde que se va a secuenciar se cargan con un tipo de desoxirribonucleótido trifosfato (dNTP). Si el dNTP introducido es complementario al nucleótido principal de la plantilla, se incluye en la cadena complementaria en crecimiento. Esto provoca la liberación de iones de hidrógeno, lo que activa el sensor de iones ISFET , que indica que se ha producido una reacción. Si está presente una repetición de un nucleótido en la secuencia de la cadena molde, se unirán varias moléculas de dNTP en un ciclo. Esto conduce a un aumento en la cantidad de iones de hidrógeno formados y a una señal eléctrica proporcionalmente más alta.
Esta tecnología se diferencia de otras tecnologías de secuenciación en que no utiliza nucleótidos modificados ni sensores ópticos . La secuenciación de semiconductores de iones también puede denominarse secuenciación de torrentes de iones, secuenciación mediada por pH o secuenciación de semiconductores. Desarrollada por Ion Torrent Systems, Inc, la tecnología obtuvo la licencia de DNA Electronics Ltd, [1] [2] y se lanzó en febrero de 2010. [3] Ion Torrent posicionó sus sistemas como secuenciadores rápidos, compactos y económicos aptos para muchos laboratorios como sistemas profesionales. [4] 454 Life Sciences de Roche está colaborando con DNA Electronics para desarrollar una plataforma compacta de ADN de lectura de secuencias largas utilizando esta tecnología. [5]
La incorporación de trifosfato de desoxirribonucleótido (dNTP) en la cadena de ADN en crecimiento ocurre con la formación de un enlace covalente y la liberación de pirofosfato y un ion de hidrógeno cargado positivamente. [1] [3] [6] El dNTP solo se incluirá si es complementario al nucleótido principal no apareado de la cadena molde. La secuenciación de semiconductores de iones se basa en el hecho de que cuando un tipo de dNTP se reemplaza por otro, se libera un ion de hidrógeno.
Los dNTP A, C, G o T no modificados se inundan secuencialmente en cada micropocillo de un chip semiconductor que contiene una molécula molde de ADN monocatenario que se va a secuenciar y ADN polimerasa . [3] [7] [8] Si el dNTP introducido es complementario al siguiente nucleótido desapareado en la hebra molde, la ADN polimerasa lo incorpora a la hebra complementaria en crecimiento. [9] Si el dNTP introducido no es complementario, no se produce la reacción de polimerización. El ion de hidrógeno que se libera en la reacción cambia el pH de la solución, lo que es detectado por el ISFET . [1] [3] [7] Las moléculas de dNTP que no han reaccionado se eliminan antes del siguiente ciclo cuando se introducen otras especies de dNTP. [7]
Los sensores ISFET están ubicados debajo de la capa sensible a iones de micropocillos . [4] Todas las capas se colocan en un chip CMOS, similar a los que se utilizan ampliamente en la industria electrónica. [4] [10]
Cada chip contiene una matriz de micropocillos con los correspondientes sensores ISFET . [7] Cada ion de hidrógeno emitido activa el sensor ISFET . Una serie de impulsos eléctricos transmitidos desde un chip a una computadora se convierte en una secuencia de ADN sin conversión de señal intermedia, [7] [11] ya que la electrónica registra directamente los eventos de inclusiones de nucleótidos en la cadena, sin el uso de nucleótidos marcados y ópticos. mediciones. [4] [10] El procesamiento de señales y el ensamblaje de secuencias de ADN se pueden realizar mediante software.
La precisión de la secuenciación de semiconductores de iones en febrero de 2011 fue del 99,6 % con un fragmento de 50 nucleótidos (lectura), 100 Mb por pase. [12] En febrero de 2011, la longitud de los fragmentos secuenciados era de 100 pares de bases. [12] La precisión de la lectura de repeticiones de 5 nucleótidos de largo fue del 98 %. [12] Estos datos aún no se han verificado de forma independiente fuera de la empresa.
Las principales ventajas de la secuenciación de semiconductores de iones son la alta velocidad de secuenciación con una inversión inicial y unos costes operativos bajos. [8] [11] Esto fue posible gracias a la ausencia de nucleótidos modificados y mediciones ópticas.
Debido a que el sistema registra los eventos de las adiciones de nucleótidos realizadas por la polimerasa natural, la secuenciación puede realizarse en tiempo real. De hecho, la velocidad de secuenciación está limitada por la velocidad de cambio del sustrato de nucleótidos . [13] Ion Torrent Systems, el desarrollador de la tecnología, afirma que la medición (fijación) de cada adición de nucleótidos tarda 4 segundos, y cada ejecución dura aproximadamente una hora, durante la cual se secuencia una secuencia de 100-200 nucleótidos. [11] [14] El progreso en el campo de los chips semiconductores (predicho por la Ley de Moore ) sugiere que el número de lecturas por chip (y por lo tanto por ejecución) debería aumentar. [once]
El costo de adquisición de un secuenciador mediado por pH de Ion Torrent Systems, Inc en el momento del lanzamiento fue de aproximadamente $ 50,000, sin incluir el equipo de preparación de muestras y un servidor para el análisis de datos. [8] [11] [14] El costo por ejecución también es significativamente más bajo que los métodos de secuenciación automatizados alternativos a alrededor de $ 1000. [8] [12]
Si un homopolímero que consta de repeticiones del mismo nucleótido (p. ej., GGGGG) está presente en la hebra molde (a secuenciar), se unen varios nucleótidos a la vez y se forman más iones de hidrógeno en un ciclo. Esto da como resultado un cambio mayor en el pH y una señal electrónica proporcionalmente más alta. [11] La limitación de este sistema es que es difícil calcular la duración de la repetición. Esta limitación la comparten otros métodos que detectan inserciones de un solo nucleótido, como la pirosecuenciación . [15] Las señales generadas por una repetición larga son difíciles de distinguir de otras similares de otras longitudes, por ejemplo, una repetición larga de 7 nucleótidos es difícil de distinguir de una repetición homo de 8 nucleótidos.
También hubo una presencia significativa de errores de secuenciación en forma de inserciones y deleciones de un solo nucleótido, generalmente en el estado heterocigoto. Para solucionar este problema, Life Technologies ha lanzado una actualización del producto de software Ion Reporter.
Otra desventaja de este sistema es la corta longitud de lectura en comparación con otros métodos de secuenciación como la secuenciación de Sanger o la pirosecuenciación . Las longitudes de fragmentos de lectura grandes son útiles para el ensamblaje del genoma de novo . Hasta la fecha, la longitud de lectura lograda por Ion Torrent Systems, Inc es de 600 pares de bases por pasada. [3] [8] Actualmente, el rendimiento es inferior al de otras tecnologías de secuenciación de alto rendimiento, aunque los desarrolladores esperan cambiar esto aumentando la densidad de micropocillos por chip . [3] En 2018, se lanzó una nueva línea de secuenciadores Ion GeneStudio S5, que es comparable en rendimiento a otras tecnologías de secuenciación del genoma completo, aunque las supera en velocidad.
La secuenciación de semiconductores de iones se posiciona en el mercado como una máquina de secuenciación rápida, compacta y económica que se puede utilizar en una gran cantidad de laboratorios como una máquina de alta gama. [3] [4] La empresa espera que su sistema se utilice no solo en centros especializados, sino también en hospitales y pequeños laboratorios universitarios e industriales. Un artículo del New York Times de enero de 2011, "Llevar la secuenciación del ADN a las masas", destaca esta ambición. [dieciséis]
Dado que los métodos de secuenciación alternativos pueden lograr longitudes de lectura más largas (y, por lo tanto, ser más adecuados para el análisis del genoma completo ), esta tecnología puede ser más adecuada para aplicaciones a pequeña escala, como la secuenciación del genoma microbiano, la secuenciación del transcriptoma microbiano, la secuenciación objetivo , la secuenciación de amplicón o para controles de calidad de secuenciación de bibliotecas. [3] [8]