La pirosecuenciación es un método de secuenciación de ADN (determinación de la secuencia de nucleótidos en una molécula de ADN ) basado en el principio de "secuenciación por síntesis". Cuando se enciende el nucleótido, se detectan los pirofosfatos liberados [1] . La tecnología fue desarrollada por Pål Nyrén ( Swed. Pål Nyrén ) y su estudiante Mustafa Ronagi Eng. Mostafa Ronaghi ) en el Royal Institute of Technology ( Estocolmo ) en 1996 [2] [3] [4] .
La idea de la pirosecuenciación es registrar el pirofosfato, que se forma cuando la ADN polimerasa agrega el siguiente nucleótido . La detección de pirofosfato se lleva a cabo debido a una cascada de reacciones químicas , que termina con la liberación de un cuanto de luz [5] .
En primer lugar, se crea una biblioteca clonal de fragmentos de ADN monocatenarios inmovilizados en la fase sólida (por ejemplo, utilizando la reacción en cadena de la polimerasa con puente , PCR). Se adjunta un adaptador a todos los fragmentos de ADN, con el que se unirá un cebador de forma complementaria , un cebador para la síntesis de una hebra complementaria por la ADN polimerasa. A continuación, se realiza una serie de ciclos sucesivos, durante los cuales desoxinucleótidosse añaden sucesivamente al ADN fijado en la fase sólida Activa una cascada de reacciones químicas: el pirofosfato junto con la adenosina sulfofosfato (ASP) con la ayuda de la enzima ATP-sulfurilasa forman ATP , que es una fuente de energía para la reacción de oxidación de luciferina a oxiluciferina con la liberación de un cuanto de luz. La intensidad de la luz emitida es proporcional al número de nucleótidos incluidos en la cadena (cuantos más nucleótidos idénticos en una fila, más fuerte es la señal luminosa). La detección de luz se lleva a cabo mediante una matriz CCD y se analiza mediante un software que crea una secuencia de nucleótidos a partir de un pirograma. Los nucleótidos que no intervienen en la síntesis de una nueva cadena, así como el ATP, son destruidos por la enzima apirasa . Después de eso, comienza el siguiente ciclo, es decir, se agrega otro tipo de nucleótido [6] .
Posteriormente, Margulis et al., propusieron una combinación de pirosecuenciación con PCR en emulsión [7] .
Pyrosequencing AB, con sede en Uppsala , Suecia , ha comercializado tecnología y reactivos para secuenciar tramos cortos de ADN. En 2003, Pyrosequencing AB pasó a llamarse "Biotage". En 2008, Qiagen adquirió Biotage [8] . La tecnología comercial 454 Life Sciences ( Roche Applied Science ) [7] se basa en el principio de pirosecuenciación .
En comparación con la secuenciación de Sanger , la pirosecuenciación se compara favorablemente con el costo, así como con el hecho de que se pueden obtener cientos de miles de lecturas a la vez . Sin embargo, la pirosecuenciación también tiene una serie de desventajas. Por lo tanto, usando este método, es imposible secuenciar inequívocamente secciones extendidas que consisten en el mismo nucleótido. Además, le permite obtener solo lecturas de pequeña longitud. La cuarta generación de tecnologías de pirosecuenciación, por ejemplo, GS FLX Titanium, permite obtener lecturas de más de 400 pares de bases [9] .