La criomicroscopía electrónica (cryo-EM, ing. cryo-EM ) o criomicroscopía electrónica es una forma de microscopía electrónica de transmisión (TEM, ing. TEM ) , en la que la muestra se examinado bajo temperaturas criogénicas (generalmente en nitrógeno líquido ). CryoEM está ganando popularidad en biología estructural , ya que permite observar especímenes que no han sido teñidos o fijados de otra manera, mostrándolos en su entorno nativo. Esto contrasta con la cristalografía de rayos X , que requiere cristalizar la muestra, lo que puede ser difícil, y colocarla en entornos no fisiológicos, lo que a veces puede conducir a cambios conformacionales funcionalmente inapropiados.
La resolución de los mapas crio-EM ha ido mejorando constantemente y en 2014 se obtuvieron estructuras con una resolución casi atómica, incluidos virus , ribosomas , mitocondrias , canales iónicos y complejos enzimáticos, con un total de 170 kD a una resolución de 4,5 Å. Bridget Carragher y sus colegas del Scripps National Resource for Automated Molecular Microscopy utilizaron los métodos que ella y Clint Potter habían desarrollado para crear la primera imagen de criomicroscopía electrónica sub-3 angstrom en biología estructural , elevando así el perfil de crio-EM como un herramienta ahora comparable y potencialmente superior a los métodos convencionales de cristalografía de rayos X. En junio de 2015, se publicó un mapa de 2,2 Å de la enzima bacteriana beta-galactosidasa . Una versión de la criomicroscopía electrónica es la tomografía crioelectrónica (CET), en la que se crea una reconstrucción 3D de una muestra con una imagen inclinada 2D.
El Premio Nobel de Química de 2017 fue otorgado a Jacques Dubochet , Joachim Frank y Richard Henderson "por el desarrollo de la criomicroscopía electrónica para la determinación de la estructura de alta resolución de biomoléculas en solución" [1] [2] [3] .
Inicialmente, la microscopía crioelectrónica estaba destinada a ser utilizada como un medio para combatir el daño por radiación a las muestras biológicas. La cantidad de radiación requerida para recolectar una imagen de una muestra en un microscopio electrónico es lo suficientemente grande como para ser una fuente potencial de daño de la muestra para estructuras delicadas. Además, el alto vacío requerido para una columna de microscopio electrónico hace que el entorno de la muestra sea bastante duro.
El problema del vacío se resolvió parcialmente con la introducción de la tinción negativa , pero incluso con ella, las muestras biológicas estaban sujetas al colapso estructural cuando la muestra se deshidrataba . La posibilidad de sumergir muestras en hielo por debajo de la temperatura de sublimación se consideró desde el principio, pero cuando el agua se congela, tiende a asentarse en una red cristalina menos densa, y esto puede destruir la estructura de todo lo que está integrado en ella.
A principios de la década de 1980, varios grupos de física del estado sólido intentaron producir hielo vítreo de varias formas, como la congelación a alta presión o la congelación instantánea. En el artículo original de 1984, un grupo dirigido por Jacques Dubochet en el Laboratorio Europeo de Biología Molecular mostró imágenes de un adenovirus incrustado en una capa vitrificada de agua. Este artículo se considera generalmente como el origen de la microscopía crioelectrónica, y la técnica se ha desarrollado hasta el punto de convertirse en estándar en muchos laboratorios de todo el mundo.
La energía de los electrones utilizados para producir la imagen (80-300 kV) es lo suficientemente alta como para romper los enlaces covalentes. Cuando se toman imágenes de especímenes susceptibles al daño por radiación, es necesario limitar la exposición de electrones utilizada para adquirir la imagen. Estas exposiciones bajas requieren que se seleccionen, alineen y promedien imágenes de miles o incluso millones de moléculas congeladas idénticas para producir mapas de alta resolución utilizando software especializado. En 2012 se logró una mejora significativa en las características estructurales mediante la introducción de detectores de electrones directos y mejores algoritmos computacionales.
Película delgada
El material biológico se extiende sobre una rejilla de microscopía electrónica y se mantiene en un estado hidratado congelado mediante congelación rápida, generalmente en etano líquido a la temperatura del nitrógeno líquido. Manteniendo las muestras a la temperatura del nitrógeno líquido o más frías, pueden introducirse en el modo de alto vacío de la columna del microscopio electrónico. La mayoría de las muestras biológicas son extremadamente sensibles a la radiación, por lo que deben obtenerse imágenes con dosis bajas (de manera útil, la baja temperatura de la criomicroscopía electrónica proporciona un factor de protección adicional contra el daño por radiación).
Por lo tanto, las imágenes son muy ruidosas. Para algunos sistemas biológicos, es posible promediar imágenes para aumentar la relación señal/ruido y extraer información de alta resolución sobre la muestra utilizando una técnica conocida como análisis de partículas individuales. Este enfoque generalmente requiere que los promedios sean idénticos, aunque ahora se puede explorar cierta heterogeneidad conformacional limitada (p. ej., ribosoma). Las reconstrucciones 3D a partir de imágenes crio-EM de complejos de proteínas y virus se han resuelto a una resolución subnanométrica o casi atómica, lo que proporciona nuevos conocimientos sobre la estructura y la biología de estos grandes conjuntos.
El análisis de matrices de proteínas ordenadas, como cristales bidimensionales de proteínas transmembrana o matrices de proteínas helicoidales, también permite promediar, lo que puede proporcionar información de alta resolución sobre la muestra. Este método se llama cristalografía electrónica.
sección vítrea
El método de película delgada se limita a muestras delgadas (típicamente <500 nm) porque los electrones no pueden atravesar muestras más gruesas sin múltiples eventos de dispersión. Las muestras más gruesas se pueden vitrificar mediante congelación por inmersión (criofijación) en etano (hasta decenas de µm de espesor) o, más comúnmente, mediante congelación a alta presión (hasta cientos de µm). Luego se pueden cortar en secciones delgadas (entre 40 y 200 nm de espesor) con un cuchillo de diamante en un criotramicrótomo a temperaturas inferiores a -135 °C (temperatura de desvitrificación). Las secciones transversales se recogen en una rejilla de microscopio electrónico y se muestran de la misma manera que una muestra vitrificada en una película delgada. Esta técnica se denomina criomicroscopía electrónica de secciones vítreas (CEMOVIS) o criomicroscopía electrónica de secciones hidratadas congeladas.
Además de visualizar muestras biológicas vitrificadas, la crio-EM también se puede utilizar para obtener imágenes de muestras de materiales que son demasiado volátiles en el vacío para obtener imágenes mediante microscopía electrónica estándar a temperatura ambiente. Por ejemplo, las interfaces líquido-sólido vitrificadas se pueden extraer para el análisis crio-EM, y el azufre, que es susceptible de sublimarse en el vacío de los microscopios electrónicos, se puede estabilizar y obtener imágenes en crio-EM [4] [5] .
Se pueden utilizar muchos métodos en microscopía crioelectrónica. Métodos populares: