Método de gramo

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El método de Gram  es un método de tinción de microorganismos para investigación, que permite diferenciar bacterias según las propiedades bioquímicas de su pared celular . Propuesto en 1884 por el médico danés Hans Christian Gram .

Según Gram, las bacterias se tiñen con tintes de anilina  , genciana o violeta de metilo , etc., luego el tinte se fija con una solución de yodo . Tras el lavado posterior de la preparación teñida con alcohol , los tipos de bacterias que resultan ser de color azul firme y tienen una pared celular gruesa se denominan bacterias grampositivas , denominadas Gram (+) , en contraste con las gramnegativas (delgadas). pared celular), Gram (-) , que se decoloró cuando se lavó.

Después de enjuagar con solvente, la tinción de Gram agrega un tinte rojo contrastante que tiñe de rojo o rosa a todas las bacterias Gram-negativas. Esto se debe a la presencia de una membrana externa que impide la penetración del colorante en la célula. La prueba clasifica las bacterias en dos grupos según la estructura de su pared celular.

Uso en diagnósticos

La tinción de Gram es de gran importancia en la taxonomía de bacterias, así como para el diagnóstico microbiológico de enfermedades infecciosas.

Bacterias grampositivas (a excepción de los representantes del género Neisseria ) y con esporas (a excepción de Coxiella burnetii ), se tiñen de color azul-negro ( azul oscuro ).

Muchas bacterias que no producen esporas son gramnegativas y se tiñen de rojo o rosa.

Técnica de tinción

La tinción de Gram se refiere a un método complejo de tinción cuando un frotis se expone a dos colorantes, uno de los cuales es el principal y el otro es adicional. Además de los tintes, los agentes blanqueadores se utilizan para métodos complejos de coloración: alcohol, ácidos, etc.

Para la tinción de Gram, los tintes de anilina del grupo trifenilmetano se usan con mayor frecuencia: genciana, violeta de metilo o violeta cristal . Los microorganismos grampositivos dan una fuerte conexión con los colorantes indicados y el yodo. Al mismo tiempo, no se decoloran cuando se exponen al alcohol, por lo que, con tinción adicional con fucsina , los microorganismos grampositivos no cambian el color púrpura adoptado inicialmente.

Los microorganismos gramnegativos forman un compuesto que se destruye fácilmente con alcohol con colorantes básicos y yodo . Como resultado, los microbios se decoloran y luego se tiñen de magenta, volviéndose rojos.

Preparación de material para pintar

  1. El material de prueba se extiende en una capa delgada sobre la superficie de un portaobjetos de vidrio bien desengrasado.
  2. El frotis preparado se seca al aire y se fija después del secado completo.
  3. Los cortes histológicos se preparan según el método estándar, fijando trozos de tejido en formalina y vertiéndolos en parafina.

Fijación

Al fijar, el frotis se fija en la superficie del portaobjetos de vidrio y, por lo tanto, durante la tinción posterior de la preparación, las células microbianas no se eliminan por lavado. Además, las células microbianas muertas se tiñen mejor que las vivas.

Se hace una distinción entre el método físico de fijación, que se basa en el efecto de la temperatura elevada sobre la célula microbiana, y los métodos químicos, que implican el uso de productos químicos que provocan la coagulación de las proteínas citoplasmáticas.

Forma física de fijación

El portaobjetos de vidrio con la preparación se toma con pinzas o dedos I y II de la mano derecha por las costillas con un golpe hacia arriba y con un movimiento suave 2-3 veces sobre la parte superior de la llama del mechero. Todo el proceso de fijación no debe durar más de 2 s.

La fiabilidad de la fijación se comprueba mediante el siguiente método: la superficie del portaobjetos libre de la mancha se aplica a la superficie posterior de la mano izquierda. Con la correcta fijación del frotis, el vaso debe estar caliente, pero no causar sensación de quemadura (70-80 °C).

Método químico de fijación

Para fijar los frotis , alcohol metílico , acetona , mezcla de Nikiforov (una mezcla de alcohol etílico 96% y éster anestésico en una proporción de 1: 1), líquido de Carnoy (96% alcohol etílico - 60%, cloroformo - 30%, acético  glacial ácido  - 10%) ), alcohol-formol (40% formalina  - 5 ml, 96% alcohol etílico - 95 ml). Un portaobjetos con un frotis seco se sumerge en una botella con un agente fijador durante 10-15 minutos y luego se seca al aire. También se utiliza la fijación en pares de formol al 40% durante unos segundos.

El proceso de tinción de frotis

  1. Uno de los tintes principales se vierte en un frotis fijo durante 2-3 minutos. Para evitar la precipitación, tiña a través de papel de filtro.
  2. Drene la pintura, retire con cuidado el papel de filtro. El frotis se llena con solución de Lugol o solución de yoduro de Gram (una solución acuosa de yoduro de potasio y yodo cristalino en una proporción de 2: 1) durante 1-2 minutos hasta que la preparación se vuelve negra.
  3. Se drena la solución, se enjuaga el frotis con alcohol etílico de 96° o acetona , se vierte y se escurre hasta que el frotis se decolora y el líquido que fluye es transparente (aproximadamente 20-40-60 segundos).
  4. Los portaobjetos se lavan a fondo con agua corriente o destilada durante 1-2 minutos.
  5. Para identificar el grupo de bacterias gramnegativas, las preparaciones se tiñen adicionalmente con fucsina o safranina (2 a 5 min).
  6. Enjuague con agua corriente y seque con papel de filtro.

Técnica de tinción de Gram-Weigert para bacterias en cortes histológicos

  1. Las secciones desparafinadas se llevan al agua.
  2. Teñir durante 20 minutos en una solución al 1% de pararosanilina o fucsina básica en ácido acético al 1% (la solución de tinte se calienta a ebullición, se enfría y se filtra).
  3. Lavado en 3 cambios de agua destilada.
  4. Teñir durante 5 min en cristal violeta al 1% en agua destilada.
  5. Enjuague rápidamente en una solución de cloruro de sodio al 1%.
  6. Tratado durante 30 s en una mezcla: 1 parte de yodo + 2 partes de yoduro de potasio + 100 partes de agua destilada.
  7. Mojado con papel filtro.
  8. Diferencie aplicando una mezcla de volúmenes iguales de anilina y xileno (1-2 ml) al corte; las soluciones se drenan hasta que las nubes de tinte dejen de alejarse del corte.
  9. Realizar mediante 3 cambios de xileno.
  10. Encerrado en bálsamo o cualquier resina disuelta en xileno.

Resultado: las bacterias Gram-positivas son de color negro azulado, la fibrina es de color púrpura, los núcleos son de color rojo.

Véase también

Literatura

En alemán
  • gramo, HCÜber die isolierte Färbung der Schizomyceten en Schnitt- und Trockenpräparaten  (alemán)  // Fortschritte der Medizin: magazin. - 1884. - Bd. 2 . - S. 185-189 .
En inglés
  • Bergey, David H.; John G. Holt; Noel R. Krieg; Peter HA Sneath. Manual de Bergey de Bacteriología Determinativa  (Inglés) . — 9.ª edición — Lippincott Williams & Wilkins, 1994.
  • Madigan, MT; Martinko J; Parker J. Brock Biología de Microorganismos  (indefinido) . — 10ª edición. Lippincott Williams & Wilkins, 2004.
  • Ryan, KJ; Ray, CG Sherris Microbiología médica  (indefinido) . - 4ª ed.- McGraw Hill., 2004.
  • Aplicación de tinciones en microbiología clínica // Biotechnic & Histochemistry, Volumen 76, Número 3, 01 de mayo de 2001, pp. 119-125(7)
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