Microelectrodo de vidrio

Un microelectrodo de vidrio es una pipeta de  vidrio muy delgada llena de un electrolito . Utilizado en electrofisiología . El desarrollo de métodos de microelectrodos hizo posible realizar estudios electrofisiológicos a nivel de células individuales.

El diámetro de la punta de un microelectrodo de vidrio es de aproximadamente 0,5 µm, a veces menos de 0,1 µm [1] ; cuando se observa a través de un microscopio óptico , puede ser indistinguible.

Este instrumento no debe confundirse con los modelos delgados de electrodos de vidrio ionométricos , en particular los que también se utilizan en electrofisiología.

Aplicación

Hay tres formas principales de usar microelectrodos:

Otro desarrollo de la tecnología de microelectrodos fue el método de fijación local del potencial ( método de abrazadera de parche ) [2] . Los tipos especiales de microelectrodos desarrollados para este método se conocen comúnmente como micropipetas . La sensibilidad del método permite registrar la actividad de canales iónicos individuales de la membrana celular.

Historia

Antes del desarrollo de los microelectrodos de vidrio en fisiología, se usaban electrodos metálicos, por ejemplo, de alambre de tungsteno molido electroquímicamente [3] . La baja resistencia eléctrica de los electrodos metálicos hizo posible utilizar con ellos equipos de grabación primitivos con una baja resistencia de entrada. En algunas áreas, estos electrodos todavía se usan en la actualidad.

Los microelectrodos de vidrio se utilizaron por primera vez en 1949 [4] por G. Ling y R. V. Gerard en su trabajo sobre el registro del potencial de membrana de los miocitos de rana .

V. L. Nastuk y A. L. Khodzhkin en 1950, utilizando la técnica de microelectrodos [5] , registraron el potencial de acción de una fibra muscular.

El uso de microelectrodos de vidrio para la aplicación de sustancias a la membrana celular fue sugerido por VL Nastuk en 1953 [6] .

En la URSS, Platon Grigoryevich Kostyuk [7] puso en práctica la técnica del microelectrodo . En la Facultad de Biología de la Universidad Estatal de Moscú, G. A. Kurella utilizó en su trabajo tanto la técnica de microelectrodos como electrodos ionométricos de vidrio en miniatura para el estudio de estructuras subcelulares.[ aclarar ] [8] .

Diseño y fabricación

El material para la fabricación de microelectrodos es un capilar de vidrio con un diámetro de aproximadamente 1 mm. Por lo general, usan la marca de vidrio " Pyrex ", con menos frecuencia usan otros tipos de vidrio: aluminosilicato 38-ЗС y vidrio de cuarzo. A menudo, un capilar con filamentos de vidrio fusionados se toma como espacios en blanco; en este caso, el llenado del microelectrodo con electrolito se facilita en el futuro. Los espacios en blanco se limpian a fondo.

Preparando la micropipeta

Se fabrica un microelectrodo de vidrio estirando y rompiendo un capilar calentado en un dispositivo especial: un extractor (microforja). Los parámetros del microelectrodo resultante dependen del tipo de vidrio seleccionado, el diámetro del capilar, la temperatura de calentamiento, el momento del inicio de la sacudida y su fuerza. [1] Los modelos más avanzados de extractores modernos controlados por microprocesador permiten programar varias formas de la punta de una micropipeta retráctil [9] , proporcionando propiedades predeterminadas y una buena repetibilidad.

La parte cilíndrica de la pieza de trabajo resultante se estrecha gradualmente, convirtiéndose en la parte perforante. Las micropipetas alargadas se examinan al microscopio; con un diámetro de punta perforante inferior a 0,5 μm, es indistinguible, perdiéndose en la franja de interferencia. En algunos casos, la punta del microelectrodo también se afila o se funde de una manera especial.

Los microelectrodos para las abrazaderas de parche también están recubiertos con silicona para garantizar la formación de un contacto de gigaohmios cuando se toca la membrana celular.

Llenado del electrodo

La pieza de trabajo se llena con un electrolito, generalmente con una solución de cloruro de potasio de 2 a 3 M. A veces se utilizan electrolitos de una composición diferente o el electrodo se rellena con un metal de bajo punto de fusión, por ejemplo, aleación de Wood [10] .

El llenado de los electrodos puede ser difícil debido al diámetro muy pequeño de su parte de trabajo. Para facilitarlo, se han propuesto una serie de técnicas: llenado al vacío, llenado previo con alcohol y luego desplazamiento del alcohol con un electrolito [11] . En la actualidad, el método propuesto por Tasaki [12] que utiliza una fibra de vidrio fusionada en una micropipeta es ampliamente utilizado, mientras que el microelectrodo se llena bajo la acción de fuerzas capilares [13] .

Conexión y control

Para conectar los electrodos al equipo de medición, se fijan en un portapinzas lleno de electrolito o se inserta un alambre de plata clorada en la parte cilíndrica del electrodo lleno .

La calidad del microelectrodo lleno y conectado se controla midiendo su resistencia, que tiene el orden de unidades de megaohmios. Una resistencia más baja indica que la punta del microelectrodo está rota, una resistencia mayor o que cambia caóticamente indica que la punta perforadora está obstruida con suciedad.

Los microelectrodos terminados se almacenan mal, por lo que generalmente se fabrican inmediatamente antes del comienzo del experimento [14] . Durante algún tiempo, no más de un día, se pueden conservar en el frigorífico, sumergidos en un vaso con electrolito. Durante el almacenamiento a largo plazo, los electrodos pierden su utilidad debido a la cristalización del electrolito, es posible que se llenen de colonias de microorganismos [15] .

Propiedades físicas y químicas de los microelectrodos

Varios procesos fisicoquímicos tienen lugar entre el microelectrodo y el medio en el que se sumerge (solución fisiológica, contenido celular).

Propiedades eléctricas de los microelectrodos

La resistencia eléctrica  es el parámetro más importante de un microelectrodo. La resistencia debe controlarse antes del inicio del experimento y, en algunos casos, incluso durante el trabajo. Para un electrodo válido, la resistencia está entre 5 y 20 MΩ. Una resistencia inferior a 1 MΩ es un signo de una parte perforante rota, más de 60 MΩ: la punta del electrodo es demasiado delgada o está obstruida con cristales precipitados o partículas del objeto en estudio [17] . La resistencia que cambia aleatoriamente también es característica de un electrodo contaminado [14] . Los electrodos con alta resistencia tienen un gran ruido intrínseco y sensibilidad a la interferencia electromagnética. A corrientes superiores a 1 nA, las características de corriente-voltaje de los microelectrodos pueden volverse no lineales. El cálculo de la resistencia de los electrodos es posible, pero es complicado y no proporciona una alta precisión, por lo tanto, en la práctica, la resistencia del electrodo se determina experimentalmente [18] .

capacitancia del electrodo . La presencia de un microelectrodo de su propia capacitancia distorsiona la forma de la señal registrada. Por lo tanto, se están haciendo esfuerzos para reducirlo y compensarlo: aumentar el diámetro de la parte cilíndrica del electrodo, reducir su longitud, tratar de usar cables lo más cortos posibles para conectar al amplificador. Para compensar la capacitancia del electrodo en la etapa de entrada del amplificador , se usa retroalimentación negativa capacitiva . La compensación de capacitancia se controla aplicando una señal rectangular al electrodo  ; con la configuración correcta, la forma de su frente no se distorsiona [19] .

Potencial de desplazamiento . Ocurre por varias razones. Los principales son:

El potencial de polarización del electrodo conectado al amplificador y sumergido en solución salina se compensa ajustando el amplificador.

Para reducir el autopotencial no deseado, también se utilizan los siguientes métodos [21] :

Tipos de microelectrodos

Microelectrodos multicanal

Los microelectrodos multicanal se utilizan a menudo en estudios que utilizan iontoforesis (microelectroforesis). Permiten el registro simultáneo de la actividad eléctrica y la introducción de sustancias activas desde ejes de micropipetas adyacentes. Por lo general, el número de canales de un electrodo tan complejo es de al menos tres: uno sirve para el registro, el segundo para la compensación y el control de los efectos de la corriente y el tercero para la introducción de la sustancia de prueba [22] .

Los canales individuales pueden estar dispuestos paralelos entre sí o coaxialmente.

La gran capacitancia parásita de los microelectrodos multicanal a veces se compensa creando una pantalla conductora pulverizando metal o grafito en su parte que no funciona [22] .

La centrifugación se puede utilizar para llenar microelectrodos multicanal con electrolitos y soluciones de sustancias de prueba .

La preparación de microelectrodos multicanal es técnicamente difícil; se ha argumentado que su fabricación es tanto un arte como una ciencia [23] .

Microelectrodos compuestos

Se utilizan para los mismos fines que los multicanal. Los microelectrodos compuestos dañan la célula con más fuerza, sin embargo, sus características eléctricas a menudo superan a las multicanal. Recolectado de microelectrodos separados, controlando el trabajo bajo un microscopio [22] .

Microelectrodo flotante

Los microelectrodos flotantes propuestos por Woodbury y Brady [24] se utilizan para registrar la actividad eléctrica de las células en los tejidos contráctiles, por ejemplo, el miocardio . Tienen un diseño ligero, con una parte cilíndrica muy corta y se fijan a un fino hilo de plata o tungsteno con una gota de barniz. Con un micromanipulador, el electrodo se lleva a la superficie del tejido y se baja sobre él. Se inyecta en el tejido bajo la influencia de su propio peso; cuando el electrodo ingresa a la celda, se nota un salto de voltaje.

Debido a la elasticidad del alambre, el electrodo puede moverse junto con el tejido en el que se inserta. En la práctica, es posible mantener el electrodo en la celda durante varios minutos. .

Micropipetas para pinzas de parche

Amplificadores para trabajar con microelectrodos de vidrio

Los amplificadores de biopotencial utilizados con microelectrodos de vidrio deben tener las siguientes características [25] :

Para trabajar con el método de abrazadera de parche , se utilizan amplificadores especializados.

Véase también

Notas

  1. ↑ 1 2 Kamkin, 2011 , pág. 26
  2. ↑ Hamill OP, Marty F., Neher E. et al. Técnicas de abrazadera de parche mejoradas para el registro actual de alta resolución de parches de membrana celular y sin cekk // Europ. J Physiok. - 1981. - vol. 391(2) págs. 85-100.
  3. ↑ Kozhechkin, 1975 , pág. 63.
  4. ↑ 1949, G. Ling & RW Gerard, El potencial de membrana normal de las fibras de sartorio de rana, en: J. Cell. compensación Physiol., 34, pág. 383-96.
  5. ↑ Nastuk WL, Hodgkin AL (1950). "La actividad eléctrica de las fibras musculares individuales". J. celular. compensación fisiol. 35:39-73
  6. ^ Nastuk WL La actividad eléctrica de la membrana de la célula muscular en la unión neuromuscular - J. Cellular Comp. fisiol. — v. 42, p.249-272, 1953
  7. ↑ Kostyuk Platon Grigorievich // Gran enciclopedia soviética  : [en 30 volúmenes]  / cap. edición A. M. Projorov . - 3ra ed. - M.  : Enciclopedia soviética, 1969-1978.
  8. ↑ Sobre los estudios de G. A. Kurella y Litvin F. F. - Kondrashin A. A., Samuilov V. D. Sun - energy - life. // La teoría de la evolución tal como está Archivado el 19 de julio de 2011 en Wayback Machine .
  9. ↑ [1] Archivado el 13 de febrero de 2018 en Wayback Machine Warner Instruments PMP-102 es un tirador controlado por microprocesador.
  10. ^ Shanes AM  - Aspectos electroquímicos de la acción fisiológica y farmacológica en células excitables - Pharmacol. Revs., v.10, p.59-164, 1958
  11. ↑ Goffman B., Cranefield P. Electrofisiología del corazón. — Traducción del inglés. Tsuzmer ES ed. Babsky E. B. - M.: Editorial de Literatura Extranjera - 1962
  12. ↑ Tasaki I., Tsukahara Y., Ito S., Wayner MJ, Yu WY Un método simple, directo y rápido para llenar microelectrodos. — Fisiol. Behav., 1968, v.3, pág. 1009-1010.
  13. ↑ Kamkin, 2007 .
  14. ↑ 1 2 Gran taller sobre fisiología: libro de texto. subsidio para estudiantes. más alto libro de texto instituciones / A. G. Kamkin y otros M.: Izd. Centro "Academia" 2007.
  15. ↑ Kozhechkin, 1975 , pág. 82.
  16. ↑ Kamkin, 1989 , pág. 108.
  17. ↑ Kamkin, 2011 , pág. 32.
  18. ↑ Kamkin, 1989 , pág. 112.
  19. ↑ Kamkin, 2011 , pág. 33.
  20. ↑ Kamkin, 2011 , pág. 34.
  21. ↑ Kozhechkin, 1975 , pág. 76.
  22. ↑ 1 2 3 Alexandrov A. A. Método de microelectroforesis en fisiología. - L.: Nauka, 1983. - 148 p. — (Métodos de investigación fisiológica).
  23. ↑ Kelly JS Aplicación microiontoforética de fármacos en neuronas individuales. - En: Manual de psicofarmacología. Nueva York; Londres, 1975, v.2, pág. 29-67
  24. ↑ Woodbury JW, Brady AJ Grabación intracelular de Tejidos en movimiento con un microelectrodo montado flexiblemente - Science, 123, p. 100-101, 1956
  25. ↑ Kamkin, 2011 , pág. 43.

Notas

  1. ↑ Con algunas simplificaciones, la velocidad de difusión (mol/s) se puede estimar de la siguiente manera: , donde  es la concentración de electrolito,  es el coeficiente de difusión,  es la mitad del ángulo interno de la punta del electrodo, constante para este tipo de electrodo,  es la radio interior de la punta perforante. Es decir, la velocidad de difusión es directamente proporcional al grosor de la punta de perforación y la concentración del electrolito que llena el microelectrodo.

Literatura