Anisotropía de fluorescencia

La anisotropía de fluorescencia ( polarización de fluorescencia)  es un fenómeno físico que consiste en diferentes intensidades de luz emitidas por un fluoróforo a lo largo de diferentes ejes de polarización . Los pioneros de la investigación en este campo de la ciencia fueron Alexander Yablonsky , Gregorio Weber [1] y Andreas Albrecht [2] . Los métodos basados ​​en el análisis de la polarización de la fluorescencia son ampliamente utilizados en el cribado de compuestos de bajo peso molecularinteractúan con proteínas y en el estudio de la estructura de las proteínas.

Principio del método

El fenómeno de la fluorescencia se basa en la transición de una molécula a un estado excitado tras la absorción de un fotón . Después de un breve retraso (el tiempo característico de fluorescencia τ ), la molécula vuelve al estado fundamental , cediendo parte de la energía en forma de calor y emitiendo otro fotón. Durante estos eventos, los electrones de la molécula se redistribuyen. En este sentido, la excitación por un fotón solo es posible con una cierta orientación del vector de campo eléctrico de luz con respecto a la molécula, y el fotón emitido está polarizado de cierta manera con respecto a la molécula.

Si un grupo de fluoróforos se ilumina con luz polarizada, las moléculas que están orientadas en un cierto rango de ángulos con respecto al plano de polarización entrarán en estado excitado. Si son estacionarios, la luz emitida también estará polarizada en un cierto ángulo. Esta anisotropía intrínseca ( r 0 ) generalmente se mide incorporando fluoróforos en un alcohol polihídrico congelado .

El grado de polarización de la luz emitida se puede reducir si los fluoróforos pueden girar libremente. El grado de disminución de la correlación entre la polarización de la luz absorbida y emitida depende de la relación entre el tiempo característico de cambio en la orientación espacial del fluoróforo ϕ y el tiempo característico de fluorescencia τ . La razón del cambio en la orientación del fluoróforo puede ser la rotación de toda la molécula o la rotación de solo su fragmento que contiene el fluoróforo. La medida de la anisotropía está relacionada con la velocidad de rotación por la siguiente relación:

,

donde r  es la anisotropía observada, r0 es la anisotropía intrínseca  de la molécula, τ  es el tiempo de fluorescencia característico y ϕ  es el tiempo de rotación característico.

Tal razonamiento es aplicable solo cuando los fluoróforos están lo suficientemente separados. Si están cerca, pueden intercambiar energía debido a la resonancia de Förster ( ing.  FRET ), lo que lleva a una disminución de la anisotropía observada o a una disminución más fuerte de la correlación. Esta implementación de FRET se conoce como emFRET (FRET de migración de energía).

Aplicación

La anisotropía de fluorescencia se puede utilizar para determinar constantes de unión o estudiar la cinética de reacciones acompañadas de cambios en los tiempos de rotación de las moléculas. Por ejemplo, si un fluoróforo se une a una molécula pequeña, su velocidad de rotación puede reducirse significativamente cuando se une a una proteína. Si el fluoróforo se une a una molécula más grande, la diferencia de polarización entre el estado libre y el unido será menor (incluso debido a la baja velocidad de rotación inicial de la molécula grande), lo que conducirá a una disminución en la precisión de la medición. El grado de unión está determinado por el cambio en la anisotropía entre los estados libre, parcialmente unido y totalmente unido (en exceso de proteína) por titulación .

Si el fluoróforo se une a una molécula grande como una proteína o ARN , su cambio de movilidad durante el plegamiento se puede utilizar para estudiar la dinámica de plegamiento.

En microscopía, el fenómeno de polarización de fluorescencia se puede aplicar para estudiar la viscosidad local del citosol o las membranas , para determinar la microestructura local de las membranas o la composición lipídica . Esto utiliza polarizadores ubicados después de la fuente de luz y frente a la cámara. Esta técnica también se puede utilizar para estudiar la interacción de moléculas en cascadas de señales en respuesta a diversas influencias.

El fenómeno emFRET y la disminución asociada de la anisotropía se pueden utilizar en el estudio la agregación de proteínas .

Notas

  1. ↑ Weber, G., 1953. Movimiento browniano de rotación y polarización de la fluorescencia de soluciones. Adv. química de proteínas 8:415-459
  2. ↑ Albrecht, A., 1961. Polarizaciones y asignaciones de transiciones: el método de fotoselección. J. Mol. Espectrosc. 6:84-108.

Literatura