La clonación libre de ligación ( LIC , Ligation Independent Cloning ), en ingeniería genética , es un método para obtener plásmidos que no utiliza reacciones de restricción y ligadura.
La tecnología de clonación sin ligasa reduce el tiempo para crear nuevas construcciones genéticas, por ejemplo, para la expresión de una proteína recombinante , y es más adecuada para una línea de producción de proteínas de alto rendimiento. Para la clonación sin ligaduras, es necesario preparar un vector LIC, una secuencia de ADN linealizada con extremos cohesivos específicos de 11 a 14 nucleótidos de longitud . Para hacer esto, la molécula del vector se hidroliza con una enzima de restricción en un sitio, luego se trata con la ADN polimerasa del fago T4 en presencia de uno de los nucleótidos. Actividad 3'-exonucleasa de esta enzimaconduce a la eliminación de nucleótidos del extremo 3' hasta que el nucleótido presente en la mezcla de reacción se encuentra en la secuencia (ver figura). La molécula del vector se prepara especialmente de tal manera que este nucleótido no aparece en ambos lados del sitio de restricción durante 11-14 unidades. Una vez que se ha aislado un vector LIC, se puede almacenar y reutilizar para clonar genes de proteínas diana en él. Los cebadores para la PCR de estos genes se eligen de manera que, por un lado, sean complementarios al principio o al final del gen diana y, por otro lado, a las regiones pegajosas del vector LIC. Luego, después de la PCR, se obtiene un gen de proteína, en el que en ambos lados hay secuencias monocatenarias de 11-14 nucleótidos de longitud, complementarias al vector. Basta mezclar dicho producto con un vector y transformar células bacterianas competentes con la mezcla para obtener plásmidos con el gen de la proteína. Por lo tanto, la clonación sin ligadura evita varios pasos de restricción, gelificación y ligadura, que pueden causar fallas en la clonación.
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