Endonucleasas de restricción

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Endonucleasas de restricción, enzimas de restricción (del latín  restrictio  - restricción) - un grupo de enzimas que pertenecen a la clase de hidrolasas que catalizan la reacción de hidrólisis de los ácidos nucleicos .

A diferencia de las exonucleasas , las enzimas de restricción no escinden los ácidos nucleicos desde el final de la molécula, sino en el medio. Al mismo tiempo, cada enzima de restricción reconoce una determinada sección de ADN con una longitud de cuatro pares de bases y escinde la cadena de nucleótidos dentro o fuera del sitio de reconocimiento.

La protección del genoma bacteriano de su propia enzima de restricción se lleva a cabo mediante la metilación de los residuos de nucleótidos de adenina y citosina (enmascaramiento) [1] .

Cuando la restricción se lleva a cabo en condiciones subóptimas, las endonucleasas exhiben una actividad estelar (una disminución en la especificidad de la restricción).

Clasificación

Hay tres tipos (o clases) principales de enzimas de restricción , cuyos sitios de reconocimiento pueden ser simétricos ( palindrómicos ) y asimétricos [2] :

Para 2007, se habían aislado más de tres mil endonucleasas de restricción. [3] Más de seiscientas restrictasas están disponibles comercialmente y se usan de forma rutinaria en los laboratorios para la modificación del ADN y la ingeniería genética . [4] [5] [6]

Isosquisomeros

Los isoesquizómeros son pares de endonucleasas de restricción que tienen una especificidad para reconocer las mismas secuencias, pero a veces difieren en la presencia de residuos de nucleótidos metilados , y cortan estas secuencias en los mismos lugares. Por ejemplo, las enzimas de restricción Sph I (CGTAC^G) y Bbu I (CGTAC^G) son isosquizómeros. La primera enzima aislada para el reconocimiento y corte específico de una secuencia determinada se denomina prototipo , y todas las demás enzimas de restricción similares se denominan isosquizómeros .

Los isosquisómeros se aíslan de diferentes cepas bacterianas y, por lo tanto, diferentes isosquisómeros pueden requerir diferentes condiciones de reacción .

Heteroesquizomeros (neoesquizomeros)

Una enzima que reconoce la misma secuencia pero la corta de manera diferente se llama heteroesquizómero (neoesquizómero) . Los isoesquizómeros son, por lo tanto, un caso especial de heteroesquizómeros. Por ejemplo, las enzimas de restricción Sma I (GGG^CCC) y Xma I (G^GGCCC) son heteroesquizómeros, pero no isosquizómeros entre sí.

Isocaudómeros

Las enzimas de restricción que reconocen secuencias completamente diferentes pero forman los mismos extremos se denominan isocaudómeros .

Enzimas de restricción artificiales

En ingeniería genética, las restrictasas artificiales son ampliamente utilizadas, obtenidas por fusión del dominio de unión al ADN del dedo de zinc con el dominio de corte del ADN de la nucleasa [7] [8] . El dominio de dedo de zinc se puede diseñar para reconocer y unirse a una secuencia de ADN deseada [9] . Una alternativa a las nucleasas con dedos de zinc son las enzimas de restricción artificiales TALEN que se obtienen fusionando el dominio de unión al ADN del efector TAL con el dominio de escisión del ADN [10] [11] [12] [13] .

Endonucleasas guiadas por ARN

Para editar el genoma en células humanas también se utilizan endonucleasas del sistema CRISPR - Cas9 , que escinden determinadas secuencias de ADN en la “punta” del ARN complementario [14] [15] [16] [17] [18] [19] . A diferencia de los dedos de zinc y TALEN, el sistema CRISPR-Cas para el reconocimiento de ADN requiere solo la creación de una secuencia de ARN “guía” adecuada, y no la creación de nuevos dominios proteicos de la enzima, lo que hace que este método sea mucho más accesible debido a su simplicidad. y costo relativamente bajo [20] [21 ] [22] [23] [24] .

Significado

En biología molecular práctica, las enzimas de restricción de tipo II se utilizan con mayor frecuencia, cuyo sitio de reconocimiento en la mayoría de los casos es un palíndromo . Todas las restrictasas de tipo II son dependientes de Mg 2+ .

Las enzimas de restricción son parte de un complejo sistema de modificación de restricción utilizado por las células bacterianas para regular el contenido y la actividad del ADN en la célula.

El descubrimiento de las enzimas de restricción en la década de 1970 , junto con el desarrollo de métodos de secuenciación del ADN , fue el principal impulso para el desarrollo de la ingeniería genética .

Actualmente, las enzimas de restricción con diferentes sitios de reconocimiento son la principal herramienta para la investigación genética y la ingeniería genética .

Véase también

Notas

  1. ↑ Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J. Biología molecular de la célula: en tres volúmenes. - 2. - Moscú: Mir, 1994. - T. 1. - 517 p. — 10.000 copias.  — ISBN 5030019855 .
  2. ↑ Ayala F. D. Genética moderna. 1987.
  3. ↑ Roberts RJ, Vincze T., Posfai J., Macelis D.  REBASE --enzimas y genes para la restricción y modificación del ADN  // Nucleic Acids Res : diario. - 2007. - vol. 35 , núm. Problema de la base de datos . - P.D269-70 . doi : 10.1093 / nar/gkl891 . — PMID 17202163 .
  4. ↑ Primrose, Sandy B.; Old, RW Principios de manipulación de genes: una introducción a la  ingeniería genética . - Oxford: Blackwell Scientific , 1994. - ISBN 0-632-03712-1 .
  5. ↑ Micklos, David A.; Bloom, Mark V.; Freyer, Greg A. Ciencia del ADN de laboratorio: una introducción a las técnicas y métodos de análisis del genoma del ADN recombinante  . — Menlo Park, California: Benjamin/Cummings Pub. Co, 1996. - ISBN 0-8053-3040-2 .
  6. ↑ Adrianne Massey; Helen Kreuzer. ADN recombinante y biotecnología: una guía para  estudiantes . -Washington, DC: ASM Press, 2001. - ISBN 1-55581-176-0 .
  7. ↑ Carroll, D. (2011) Ingeniería del genoma con nucleasas con dedos de zinc. Genética, 188(4), 773-782. doi : 10.1534/genética.111.131433
  8. ↑ Fujii W, Kano K, Sugiura K, Naito K (2013) Método de construcción repetible para la nucleasa de dedos de zinc diseñada basada en PCR de extensión superpuesta y clonación TA. PLoS ONE 8(3): e59801. doi : 10.1371/journal.pone.0059801
  9. ↑ Zhu, C., Gupta, A., Hall, VL et al. & Wolfe, SA (2013). Uso de interfaces definidas de dedo a dedo como unidades de ensamblaje para construir nucleasas de dedo de zinc. Investigación de ácidos nucleicos, 41(4), 2455-246541 doi : 10.1093/nar/gks1357 .
  10. ↑ Mussolino, C. y Cathomen, T. (2012). Nucleasas TALE: ingeniería genómica personalizada simplificada. Opinión Actual en Biotecnología, 23(5), 644-650 doi : 10.1016/j.copbio.2012.01.013
  11. ↑ Beumer, KJ, Trautman, JK, Christian, M., et al. y Carroll, D. (2013). Comparación de nucleasas con dedos de zinc y nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción para la selección de genes en Drosophila. G3: Genes| Genomas| Genética, 3(10), 1717-1725 doi : 10.1534/g3.113.007260
  12. ↑ Sun, N. y Zhao, H. (2013). Nucleasas efectoras similares a activadores de transcripción (TALEN): una herramienta altamente eficiente y versátil para la edición del genoma. Biotecnología y bioingeniería, 110(7), 1811-1821 doi : 10.1002/bit.24890
  13. ↑ Zhang Z, Zhang S, Huang X, Orwig KE, Sheng Y (2013) Montaje rápido de TALEN personalizados en múltiples sistemas de entrega. PLoS ONE 8(11): e80281. doi : 10.1371/journal.pone.0080281
  14. ↑ Cho, SW, Kim, S., Kim, JM y Kim, JS (2013). Ingeniería genómica dirigida en células humanas con la endonucleasa guiada por ARN Cas9. Biotecnología de la naturaleza, 31, 230-232. doi : 10.1038/nbt.2507
  15. ↑ Hsu, PD, Scott, DA, Weinstein, JA, et al. & Zhang, F. (2013) Especificidad de la orientación del ADN de las nucleasas Cas9 guiadas por ARN. Biotecnología de la naturaleza, 31(9), 827-832. doi : 10.1038/nbt.2647
  16. ↑ Golic, KG (2013) Nucleasas guiadas por ARN: una nueva era para diseñar los genomas de organismos modelo y no modelo. Genética, 195(2), 303-308. doi : 10.1534/genética.113.155093
  17. ↑ Ran, F.A., Hsu, P.D., Wright, J., et al. y Zhang, F. (2013). Ingeniería del genoma mediante el sistema CRISPR-Cas9. Protocolos de la naturaleza, 8(11), 2281-2308 doi : 10.1038/nprot.2013.143
  18. ↑ Giedrius Gasiunas, Virginijus Siksnys (2013) Endonucleasa de ADN dependiente de ARN Cas9 del sistema CRISPR: ¿Santo Grial de la edición del genoma? Archivado el 5 de diciembre de 2013 en Wayback Machine Trends in Microbiology, 21(11), 562-567, doi : 10.1016/j.tim.2013.09.001
  19. ↑ Luhan Yang, Prashant Mali, Caroline Kim-Kiselak y George Church (2014) Edición dirigida del genoma mediada por CRISPR-Cas en células humanas. En: Corrección de genes. Métodos y protocolos. Serie: Métodos en Biología Molecular, vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
  20. ↑ Uri Ben-David (2013) Fluyendo a través de CRISPR-CAScade: ¿La edición del genoma impulsará las terapias celulares? Archivado el 17 de noviembre de 2015 en Wayback Machine Molecular and Cellular Therapies 2013, 1:3 doi : 10.1186/ 2052-8426-1-3
  21. ↑ Neena K. Pyzocha, F. Ann Ran, Patrick D. Hsu y Feng Zhang (2014) Edición del genoma guiada por ARN de células de mamífero. En: Corrección de genes. Métodos y protocolos. Serie: Métodos en Biología Molecular, vol. 1114 Storici, Francesca (Ed.) ISBN 978-1-62703-760-0
  22. ↑ Li, M., Suzuki, K., Kim, NY, Liu, GH y Belmonte, JCI (2013). Un corte por encima del resto: tecnologías de edición del genoma específicas en células madre pluripotentes humanas. Revista de Química Biológica, jbc-R113. doi : 10.1074/jbc.R113.488247
  23. ↑ Slaymaker, IM, Gao, L., Zetsche, B., Scott, DA, Yan, WX y Zhang, F. Nucleasas Cas9 diseñadas racionalmente con especificidad mejorada  //  Ciencia: revista. - 2016. - Vol. 351 , núm. 6268 . - P. 84-88 . -doi : 10.1126 / ciencia.aad5227 .
  24. ↑ Kleinstiver BP, Pattanayak V., Prew MS, y J. Keith Joung et al. Nucleasas CRISPR-Cas9 de alta fidelidad sin efectos fuera del objetivo detectables en todo el genoma  (inglés)  // Nature: revista. - 2016. - doi : 10.1038/nature16526 .
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