Las reacciones bioortogonales son reacciones químicas que pueden ocurrir dentro de los sistemas vivos sin interferir con los procesos bioquímicos naturales [1] [2] [3] . Los grupos funcionales involucrados en reacciones bioortogonales, por regla general, no se encuentran en biomoléculas, reaccionan rápida y selectivamente entre sí en condiciones de células vivas y son inertes con respecto a otros compuestos que están presentes en el cuerpo. El término fue propuesto por Caroline Bertozzi en 2003 [4] . El nombre de las reacciones se basa en el significado figurativo de la palabra " ortogonal ", es decir, independiente de cualquier cosa, y denota la independencia mutua del flujo de procesos artificiales y naturales.
A pesar de que en el campo de la química orgánica se han descubierto, estudiado y descrito un gran número de reacciones químicas, prácticamente ninguna de ellas puede llevarse a cabo en una célula u organismo de forma que afecte únicamente al compuesto de interés para el investigador ( proteína , ADN , metabolito , etc.). Esto sucede porque las biomoléculas contienen una gran cantidad de grupos funcionales muy similares en reactividad (principalmente nucleofílicos ), y la reacción en la que entra el compuesto en estudio afectará inevitablemente a otras moléculas que contienen grupos funcionales similares, lo que puede no solo no cumplir con los objetivos de la estudio, pero también interrumpe el trabajo natural de la célula, por lo que es imposible estudiarlo [5] . Al mismo tiempo, realizar reacciones químicas en el interior de la célula es una herramienta de investigación útil, ya que permite etiquetar las biomoléculas estudiadas con etiquetas fluorescentes , de afinidad y espectrométricas de masas , que permitirán posteriormente observar estas biomoléculas mediante métodos de investigación adecuados. por ejemplo, usando un microscopio fluorescente . Las reacciones bioortogonales están diseñadas para llenar este vacío, ya que son absolutamente ajenas a la célula, ocurren entre grupos funcionales introducidos artificialmente y tienen poco efecto sobre el funcionamiento de la célula [3] .
El uso de la reacción bioortogonal en la práctica se suele llevar a cabo en dos etapas. Primero, el compuesto en estudio se modifica con un grupo funcional bioortogonal dentro de la célula. Luego, se introduce en el sistema un marcador de bajo peso molecular que contiene un grupo funcional complementario y, como resultado de una reacción bioortogonal, se produce una modificación selectiva (marcaje) de este compuesto [3] [5] . Posteriormente, la etiqueta introducida le permite monitorear el sustrato modificado.
Las reacciones bioortogonales ahora han hecho posible estudiar varias biomoléculas , como glucanos , proteínas [6] y lípidos [7] , en tiempo real en sistemas vivos en ausencia de citotoxicidad . Se han desarrollado varias reacciones químicas que cumplen con los requisitos de bioortogonalidad, entre ellas la cicloadición 1,3-dipolar azidas a ciclooctinas (también llamada reacción de clic libre de cobre ) [8] , nitronas a ciclooctinas [9 ] , formación de oximas o hidrazonas a partir de compuestos carbonílicos [10] , reacción de tetrazinas con ciclooctenos [11] , reacción click de isonitrilos y ligamiento de cuadriciclanos [13] .
La primera observación de modificación covalente selectiva mediante una reacción química en condiciones celulares apareció en el trabajo de R. Qian et al., quienes utilizaron fluoresceína con dos grupos funcionales arsina para modificar selectivamente una proteína en la que se fragmenta un fragmento de tetracisteína , que es prácticamente ausente en las proteínas de los mamíferos , se introdujo previamente [14] . Este enfoque hizo posible introducir una pequeña etiqueta fluorescente en la proteína, mientras que el método estándar de esa época era obtener híbridos con proteína fluorescente verde o sus análogos [15] , que son mucho más grandes y, como resultado, a veces interfieren con el funcionamiento normal de la proteína en estudio.
Este enfoque llevó a los químicos a buscar reacciones químicas y grupos funcionales que fueran absolutamente ajenos a los compuestos naturales, y a los biólogos a inventar formas de introducir funciones bioortogonales en biomoléculas. El primer paso fue darse cuenta de que las biomoléculas contienen principalmente grupos nucleófilos , mientras que los grupos electrofílicos son mucho menos comunes en ellas. Por ejemplo, las cetonas y los aldehídos no se encuentran en las proteínas, mientras que al mismo tiempo muestran reactividad frente a los grupos hidrazida e hidroxiamina, que tampoco se encuentran en las biomoléculas. Debido a esto, a fines de la década de 1990, la modificación de glicanos y proteínas a través de azúcares y aminoácidos que contienen cetonas introducidos metabólicamente se hizo posible dentro de la célula. Las cetonas y los aldehídos, sin embargo, estaban presentes en metabolitos de bajo peso molecular (azúcares, piruvato , fosfato de piridoxal , etc.), es decir, no eran completamente bioortogonales [16] .
Posteriormente, los químicos buscaron reacciones bioortogonales que ocurrieran entre grupos funcionales completamente no naturales. La reacción de Staudinger fue la primera reacción química adaptada para realizar modificaciones en el interior de la célula. El grupo azida que entra en esta reacción pertenece a los electrófilos blandos, que no son capaces de reaccionar con los nucleófilos duros más comunes en la naturaleza. El compañero de la azida fue la fosfina, un nucleófilo blando propuesto por G. Staudinger en 1919 [17] . En 2000, C. Bertozzi modificó la reacción de Staudinger y la aplicó como ligadura bioortogonal de Staudinger para marcar una amplia gama de biomoléculas tanto en células vivas como en organismos completos [18] .
Al mismo tiempo, comenzó a desarrollarse la química del clic , un concepto químico que describe la preparación de bibliotecas de compuestos orgánicos utilizando reacciones rápidas y confiables que permiten ensamblar moléculas a partir de pequeños bloques de construcción [19] . Entre varias reacciones que satisfacen este concepto, la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre ha encontrado la aplicación más amplia para la modificación in vitro de biomoléculas [20] . Sin embargo, debido a la toxicidad del catalizador de cobre, tal reacción no podría usarse en células u organismos vivos. El grupo de C. Bertozzi creó una variante no catalítica de esta reacción, conocida como cicloadición de azida-alquino facilitada por estrés (SPAAC), que es una reacción bioortogonal prometedora [8] .
Actualmente continúa la búsqueda de nuevas reacciones bioortogonales para poder realizar modificaciones paralelas de sustratos en un mismo sistema biológico.
En el caso ideal, la reacción bioortogonal debería cumplir las siguientes condiciones particulares [3] [4] :
Esta reacción fue desarrollada por el grupo de C. Bertozzi en el año 2000 sobre la base de la reacción clásica de Staudinger entre azidas y triarilfosfinas [18] . Esta reacción se convirtió en el antepasado del campo de la química bioortogonal, ya que los grupos que reaccionan en ella (azidas, fosfinas) no están presentes en las biomoléculas, pero ahora no se usa tan ampliamente. La ligadura de Staudinger se ha utilizado para modificar biomoléculas tanto en células vivas como en ratones [4] .
En la reacción de Staudinger, el grupo azida actúa como un electrófilo blando , reaccionando con nucleófilos blandos como las fosfinas . La mayoría de los nucleófilos biológicos, por el contrario, son nucleófilos rígidos que no reaccionan con las azidas. Además, la ligadura de Staudinger procede en un medio acuoso con la formación de un producto estable [18] .
Las fosfinas están ausentes en las biomoléculas naturales [21] y no restauran los enlaces disulfuro .
Usando el ejemplo de las drogas ( azidotimidina ), se ha demostrado que las azidas son biocompatibles . El pequeño tamaño del grupo azida facilita su introducción en las biomoléculas a través de vías metabólicas [8] .
La base de la reacción de Staudinger es el ataque nucleofílico de la fosfina sobre el átomo de nitrógeno terminal del grupo azida para formar fosfazida 1 . Luego, la fosfazida 1 se convierte en iminofosforano 3 , acompañada de la liberación de nitrógeno, después de lo cual se produce la hidrólisis del iminofosforano con la formación de óxido de amina y fosfina. Para aplicaciones en el campo de la bioconjugación , la reacción se modificó introduciendo un grupo éster en la posición orto de uno de los sustituyentes arilo de la fosfina. Como resultado del ataque del iminofosforano 3 resultante sobre este grupo, se forma un producto bicíclico 4 , cuya hidrólisis conduce a la formación de un enlace amida estable entre el sustrato y el marcador introducido. El paso limitante de la velocidad de la reacción es el ataque del grupo azida por la molécula de fosfina [22] .
La principal desventaja de esta reacción es que las fosfinas se oxidan lentamente por el oxígeno en los sistemas vivos. Además, probablemente sean metabolizados por los citocromos P450 [4] . La ligadura según Staudinger procede bastante lentamente, según la cinética de segundo orden, con una constante de velocidad de alrededor de 0,0020 M- 1 s - 1 [4] . Los intentos de acelerar el ataque nucleofílico mediante la introducción de grupos donantes de electrones en los sustituyentes arilo aceleran la reacción, pero también aumenta la tasa de oxidación de la fosfina.
La velocidad de reacción lenta requiere un aumento en la concentración de fosfina utilizada, lo que aumenta la señal de fondo producida por el exceso de marcador. Se hizo un esfuerzo para superar este problema: se sintetizaron fosfinas fluorogénicas a base de fluoresceína [23] y cumarina [24] , cuya acción se basa en la acumulación de fluorescencia solo después de la incorporación a la biomolécula, lo que permitió obtener una mayor salto en la intensidad de la radiación como resultado de la reacción. En la actualidad, la cinética de la reacción sigue siendo un serio obstáculo para su uso generalizado.
La cicloadición de azida-alquino libre de cobre es una reacción bioortogonal desarrollada por C. Bertozzi como una versión activada de la reacción de Huisgen . A diferencia de la cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre ( CuAAC , cicloadición de azida-alquino catalizada por Cu), esta variante de la reacción procede a una velocidad mayor debido a la eliminación de la tensión angular en la molécula de ciclooctino durante la formación del producto de adición. Por lo tanto, esta reacción se conoció como cicloadición de azida-alquino promovida por tensión ( SPAC ). Esta modificación permite evitar el uso de un catalizador de cobre tóxico y utilizar una reacción libre de cobre en células y organismos vivos.
La clásica cicloadición de azida-alquino catalizada por cobre es una reacción de bioconjugación muy rápida y eficiente , sin embargo, no se puede utilizar en células vivas debido a la toxicidad de los iones Cu + . La toxicidad se atribuye a la formación de especies reactivas de oxígeno generadas por catalizadores de cobre.
Los ligandos se han optimizado para evitar efectos nocivos en las biomoléculas; sin embargo, se ha demostrado que diferentes entornos de ligandos en los complejos también afectan el metabolismo, ya que introducen cambios no deseados en los procesos celulares [25] .
El grupo azida es bioortogonal, ya que es más bien pequeño (tiene poco efecto sobre la penetración de la molécula en la célula), metabólicamente estable y no se presenta en biomoléculas nativas. Aunque las azidas no son los compuestos más reactivos en la adición dipolar 1,3, se prefieren debido a la ausencia de reacciones secundarias en las condiciones de modificación [26] . El fragmento de ciclooctino es más grande, pero tiene la ortogonalidad y la estabilidad requeridas para la modificación in vivo . Las ciclooctinas son los alquinos cíclicos estables más pequeños . La tensión angular calculada en sus ciclos es de 19,9 kcal/mol [27] .
La reacción procede como una cicloadición dipolar 1,3 estándar con un desplazamiento de electrones pericíclico emparejado. La naturaleza ambivalente del dipolo 1,3 hace que sea imposible determinar el centro electrofílico y nucleófilo en la azida, por lo que la imagen de la dirección de transición de electrones no tiene sentido. Sin embargo, los cálculos muestran que el átomo de nitrógeno interno lleva la mayor carga negativa [28] .
La cicloadición de azida-alquino sin cobre se ha adaptado para usar nitronas en lugar de azidas . En este caso, se forman isoxazolinas sustituidas en N como productos de reacción . La velocidad de reacción aumenta en medio acuoso y obedece a una cinética de segundo orden con una constante de 12 a 32 M – 1 s– 1 , dependiendo de los sustituyentes en la nitrona. A pesar de la alta velocidad de la reacción, su desventaja es la dificultad de introducir la nitrona en la biomolécula por marcaje metabólico. La reacción se utilizó para la modificación de péptidos modelo y la pegilación de proteínas [9] .
En 2009, se desarrolló una reacción de cicloadición dipolar de óxidos de nitrilo a norborneno . En particular, se ha aplicado a la modificación postsintética de oligonucleótidos . El norborneno fue elegido como el dipolarófilo debido al equilibrio entre la reactividad y la estabilidad promovidas por el estrés. Las desventajas de esta reacción son la alta electrofilia del óxido de nitrilo, que conduce a reacciones secundarias, así como la baja velocidad de reacción [29] .
La reacción de cicloadición de oxanorbornadieno con azidas procede con la posterior eliminación de furano por la reacción de retro-Diels-Alder. La tensión del anillo y el agotamiento de electrones del oxanorbornadieno aumentan su reactividad en el paso limitante de la cicloadición. La escisión de furano se produce rápidamente con la formación de 1,2,3- triazol estable [30] . Estudios preliminares han demostrado la utilidad de esta reacción en la modificación de péptidos , y también se ha utilizado en la creación de compuestos de imagen en SPECT [31] .
La cicloadición de s - tetrazinas y ( E ) -ciclooctenos procede como una reacción de Diels-Alder , seguida de una reacción de retro-Diels-Alder con liberación de nitrógeno. La reacción transcurre muy rápidamente con una constante de velocidad de segundo orden de 2000 M – 1 s– 1 (9:1 en el sistema metanol – agua ), lo que permite modificar biomoléculas en concentraciones muy bajas.
El cálculo mostró que la energía de estrés en ( Z )-ciclooctenos es de 7,0 kcal/mol, que es menor que en el ciclooctano (12,4 kcal/mol), debido a la pérdida de dos interacciones transanulares. Por el contrario, la configuración ( E ) del doble enlace aumenta considerablemente la tensión del anillo (17,9 kcal/mol), lo que tiene un efecto positivo en la velocidad de reacción [32] . Como dienófilo, se usa 3,6-diaril- s - tetrazina, que contiene sustituyentes para suprimir la interacción con el agua. La liberación de nitrógeno en la segunda etapa hace que la reacción sea irreversible [33] .
Se ha encontrado que el agua acelera la reacción de tetrazinas con ciclooctenos. Los norbornenos también se utilizaron como dienófilos, pero la reacción fue mucho más lenta (1 M – 1 s– 1 en medio acuoso). La reacción de tetrazinas con ( E )-cicloocteno se usó para marcar células vivas con un marcador fluorescente [34] y para combinar polímeros [35] .
La reacción de clic de los isonitrilos es una cicloadición [4+1] seguida de una reacción retro-Diels-Alder para liberar N 2 . Por esta razón, la reacción es irreversible. El producto es estable si se utiliza isonitrilo terciario. En el caso de los isonitrilos primarios y secundarios, se forma una imina, que luego se hidroliza rápidamente (se muestra en rojo en el diagrama).
El isonitrilo es un buen grupo bioortogonal debido a su pequeño tamaño, estabilidad, no toxicidad y ausencia de sistemas biológicos. Sin embargo, la reacción de cicloadición [4+1] procede lentamente con una constante de velocidad de segundo orden de 10–2 M – 1 s– 1 .
El tetrazol puede sufrir una reacción de cicloeliminación fotoinducida con liberación de nitrógeno. En este caso, se forma un dipolo 1,3 de vida corta , que entra en una cicloadición dipolar 1,3 con alquenos , lo que da lugar a aductos de pirazolina [36] .
La fotoinducción procede con una exposición breve a la luz (la longitud de onda depende del tetrazol). El tiempo de exposición se selecciona para reducir el daño causado por la luz a las células. La reacción se acelera en un medio acuoso y da un único regioisómero . Las ventajas de este enfoque radican en la posibilidad de control espacial y temporal sobre la reacción. El uso de la reacción también se simplifica por el hecho de que se pueden introducir alquenos o tetrazoles en biomoléculas usando métodos biológicos simples. Además, se ha creado un tetrazol fluorogénico que permite controlar el grado de reacción en el tiempo [37] .
Durante la ligadura de cuadriciclanos, el cuadriciclano deformado entra en cicloadición [2+2+2] con sistemas π. El cuadriciclano no se encuentra en biomoléculas nativas, no reacciona con ellas (debido a la saturación de la molécula), tiene un tamaño relativamente pequeño y un voltaje fuerte (≈ 80 kcal/mol). Sin embargo, es muy estable a temperatura ambiente y en ambientes acuáticos a pH fisiológico. Es capaz de reaccionar selectivamente con sistemas π deficientes en electrones, pero no con alquenos , alquinos o ciclooctinos simples [13] .
Se seleccionó bis(ditiobencil)níquel(II) como segundo reactivo como resultado del cribado de reactividad. Para evitar la inversión fotoinducida a norbornadieno, se añade dietilditiocarbamato a la reacción, que quela el níquel en el producto resultante. La reacción transcurre con una constante de velocidad de segundo orden de 0,25 M- 1 s - 1 (en un medio acuoso).
Con el uso de esta reacción, así como la cicloadición de azida-alquino libre de cobre y la reacción de formación de oxima , se creó un método para el marcaje simultáneo de tres sustratos sin interferencia mutua de estas tres reacciones [13] .
Varias reacciones bioortogonales, principalmente la ligadura de Staudinger y la cicloadición de azida-alquino libre de cobre, son ampliamente utilizadas en los campos de la bioconjugación y la biología química .
Los sistemas de síntesis de proteínas celulares, así como las enzimas, pueden introducir aminoácidos no naturales en las estructuras de las proteínas, confundiéndolos con los naturales. En particular, se comprobó que la sustitución de la metionina en el medio nutritivo de las bacterias por homopropargilglicina ( Hpg ) o azidohomoalanina ( Aha ) permitía integrar estos aminoácidos sintéticos en proteínas sintetizadas por la célula. Tales proteínas contenían grupos funcionales bioortogonales, azida o alquino, y la introducción de biotina y colorantes fluorescentes equipados con un grupo funcional complementario (fosfina, ciclooctino o azida) en la célula hizo posible etiquetar y estudiar selectivamente estas proteínas. Además, la azidohomoalanina y la homopropargilglicina se han utilizado simultáneamente para modificar dos tipos diferentes de proteínas en paralelo [38] .
La química bioortogonal también ha encontrado aplicación en el perfilado de actividad de proteínas proteínas que tienen afinidad por un ligando en particular . Para ello, el ligando se marca con un grupo funcional bioortogonal y se introduce en la célula. Una vez que se ha producido la unión de las proteínas al ligando, la célula se destruye y la totalidad de todas las proteínas se introducen en la reacción con algún marcador que contenga un grupo reactivo complementario. En este caso, el marcador se introduce sólo en el ligando y permite distinguir y aislar sólo aquellas proteínas que están asociadas a este ligando [39] .
Los glicanos no están directamente codificados genéticamente y no tienen la actividad específica de las proteínas, por lo que los métodos de marcaje genético o de afinidad no les son aplicables. Sin embargo, los glicanos pueden modificarse metabólicamente con carbohidratos sintéticos modificados ( ácido siálico , N -acetilgalactosamina, N -acetilglucosamina, etc.) que contengan grupos azida. Los glicanos con grupos azida incrustados se introdujeron en la ligadura de Staudinger con un reactivo de biotina y se estudiaron mediante citometría de flujo [18] .