Micromatriz de ADN

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El microchip de ADN , o DNA chip ( del inglés  DNA microarray ) es una tecnología utilizada en biología molecular y medicina . Una micromatriz de ADN es un conjunto de pequeñas moléculas monocatenarias llamadas sondas de ADN que están unidas covalentemente a una base sólida [1] [2] . Cada una de estas sondas tiene una secuencia de nucleótidos estrictamente definida y un lugar en la micromatriz. Sondas idénticas se colocan juntas para formar un sitio de micromatriz. Existe una correspondencia biunívoca entre el sitio y la secuencia de ADN de la sonda. Las micromatrices de ADN se utilizan para identificar ADN o ARN (generalmente después de la transcripción inversa) que pueden o no codificar proteínas. La medición de la expresión génica por medio de ADNc se denomina perfil de expresión o análisis de expresión. En los microarreglos modernos, es posible localizar completamente el genoma completo, del cual cada gen conocido será una sonda [3] .

Principio del método

El funcionamiento de los microarreglos de ADN se basa en el fenómeno de la hibridación . En presencia de pequeñas cantidades de ADN de la muestra de prueba, se lleva a cabo la amplificación. Para el ARN primero se realiza la transcripción inversa que, sin embargo, no es necesaria: hay chips que funcionan tanto con ADN como con ARN. La verificación de muestras de ADN/ARN consiste en etiquetar las muestras con varios marcadores fluorescentes para su posterior detección y aplicar las muestras a un microchip. El microchip de ADN con la muestra aplicada se incuba durante algún tiempo para que se produzca la hibridación de moléculas monocatenarias complementarias, después de lo cual se lava el chip. Todas las muestras de ADN/ARN no complementarias se lavan del chip. Después de eso, el microchip se escanea con un láser, lo que provoca la fluorescencia de las moléculas de muestra marcadas. Un microscopio conectado a una computadora evalúa la fluorescencia de cada sitio del microarreglo de ADN y, en consecuencia, establece las secuencias de ADN hibridado, lo que permite determinar la secuencia de ADN, ARN de la muestra [4] .

Historia

La tecnología de micromatrices de ADN tiene su origen en la transferencia de Southern  , una técnica en la que el ADN fragmentado se transfiere a un soporte adecuado y luego, utilizando una sonda con una secuencia de nucleótidos conocida, se determina el contenido de la secuencia objetivo en la muestra. Por primera vez, en 1987 se utilizó un conjunto de diferentes ADN combinados en un chip para determinar las características de la regulación de la expresión génica por los interferones [5] . Las primeras micromatrices de ADN se hacían depositando microcantidades de ADNc en papel de filtro . El uso de chips en miniatura para determinar las características de la expresión génica se implementó en 1995 [6] y el genoma eucariota completo ( Saccharomyces cerevisiae ) se colocó en una micromatriz en 1997 [3] .

Ensamblaje de microarrays de ADN

Los fragmentos de ADN amplificados se aplican a placas de silicio o vidrio utilizando un micromanipulador, fijando covalentemente las sondas. En 1991-1993, se propuso otro enfoque basado en la tecnología de fotolitografía utilizada en la industria de los semiconductores. Más tarde, en 1997, se patentó otro método: el "electroenfoque" [2] .


Fotolitografía

El montaje comienza con la aplicación de una capa fotosensible protectora especial sobre una placa de vidrio de 12,8 × 12,8 mm, que hace que la propia placa sea inerte. Solo aquellos lugares donde se iluminará la capa protectora pueden unir desoxirribonucleótidos (A, T, G, C). Después de la exposición a la luz, se aplica a la placa una solución de una de las bases . Todos los demás lugares están protegidos por una máscara fotolitográfica especial, por lo que los desoxirrubonucléotidos se unen covalentemente a la placa exactamente en los lugares correctos, después de lo cual se lava todo lo que no pudo conectarse. Los propios nucleótidos se modifican químicamente para que solo puedan unirse a otro nucleótido cuando se exponen a la luz [7] . Repitiendo repetidamente los ciclos de máscara - iluminación - aplicación del nucleótido - lavado tantas veces como sea necesario y cambiando constantemente las máscaras, se puede lograr la creación de secuencias únicas. Se están desarrollando varias máscaras para crear un chip, de acuerdo con los requisitos para las sondas resultantes [2] .

Cadenas de ADN monocatenario idéntico, dispuestas en un cuadrado de 90x90 µm , crecen nucleótido a nucleótido en la superficie de la placa. Cada cuadrado termina conteniendo miles de millones de sondas idénticas. Ahora la fotolitografía se utiliza para crear sondas relativamente cortas, de no más de 100 nucleótidos. Al mismo tiempo, la cantidad de máscaras reemplazadas durante el ensamblaje de dicho chip es comparable a la longitud de las sondas: por ejemplo, para ensamblar sondas de 18 a 25 nucleótidos de largo, se requieren alrededor de 40 máscaras en un chip. En la práctica, un gran número de micromatrices de ADN idénticas se fabrican juntas en un gran sustrato de vidrio [2] .


Electroenfoque

El ensamblaje de tales microchips requiere sustratos especialmente complejos, que son esencialmente chips electrónicos, con muchas salidas, cada una de las cuales controla el voltaje en un lugar determinado de la placa. A diferencia de la fotolitografía, donde las sondas se ensamblan base por base, aquí, los oligonucleótidos monocatenarios listos para usar se entregan en los lugares deseados de la placa bajo la acción de un campo eléctrico. Se crea un voltaje positivo en el lugar correcto de la placa usando la salida apropiada del microchip. El ADN monocatenario cargado negativamente se mueve hacia la carga positiva generada y se adhiere en el lugar correcto. Después de eso, se activa la siguiente salida del microchip, dando una carga positiva en otra parte de la placa, donde se envía la siguiente sonda. La densidad del ADN en dichos chips es mucho menor que en los chips obtenidos por fotolitografía [8] [2] .

Experimento

Existen tres tipos básicos de micromatrices: para el análisis de la expresión génica (microarray GEM), para la hibridación genómica comparativa (MCGH) y para la detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNPM) [9] . El protocolo básico se puede representar de la siguiente manera [10] :

1. Aislamiento de ADN/ARN

En este paso, se aíslan fragmentos de ARNm (GEM) o ADN genómico (MCGH, SNPM) de las muestras de interés. Ahora bien, esto se hace fácilmente con kits comerciales especiales [10] [11] .

2. Etiquetado de ADN/ARN

Este proceso comienza con la transcripción inversa (si es necesario). Luego se lleva a cabo la amplificación del fragmento objetivo utilizando la reacción en cadena de la polimerasa . Durante el proceso de PCR, los nucleótidos con marcadores fluorescentes se incluyen en la composición de los fragmentos de ADN [10] [12] .

3. hibridación

Aquí, las muestras amplificadas marcadas con fluorescencia se utilizan como objetivos para buscar cadenas complementarias en el microchip, es decir, capaces de formar fuertes cadenas dobles - dúplex, de acuerdo con la regla de la complementariedad . Como ejemplo, secuencias complementarias 5'-GCATGCAT-3’y 3’-CGTACGTA-5’. Dado que una de las cadenas del dúplex formado está marcada, la señal de dicho dúplex puede registrarse [10] .

4. Lavado

Tan pronto como se completa la hibridación, el chip se retira de la solución que contiene las muestras de ADN marcadas. Luego, el chip en sí se lava a fondo de acuerdo con ciertos métodos, usando varias mezclas de tampones, centrifugación, etc. [10] .

5. Escanear

Este proceso implica el uso de sondas de exploración óptica capaces de detectar fotones de una longitud de onda definida con precisión. Cada sitio del chip se ilumina con un haz de luz de cierta longitud de onda, que activa la etiqueta fluorescente. El "silencio" del microchip es producido por láseres de argón. La etiqueta fluorescente activada emite un fotón de longitud de onda ligeramente mayor, que es registrado por el dispositivo. Cuantos más fotones captura el dispositivo en una luz, mayor es la intensidad del brillo de un punto dado, lo que significa que se forma una gran cantidad de dúplex [10] .

6. Análisis de datos

Los datos son una matriz de valores de intensidad de brillo para cada sitio específico de la micromatriz. Utilizando métodos matemáticos de comparación, es posible determinar de forma fiable los sitios del chip donde se ha producido la hibridación y, por tanto, averiguar la secuencia de ADN/ARN de la muestra [10] [13] .

Aplicaciones

Análisis de expresión génica

Esta es la aplicación más común de los microarrays de ADN. El ARN aislado del cultivo celular se somete a una transcripción inversa , lo que da como resultado un ADNc marcado. A veces se requiere otro paso de transcripción del ADNc (para chips de ARN) para crear un ARNc marcado. Hay varias formas diferentes de marcar la molécula diana: la inclusión de nucleótidos marcados con fluorescencia durante la síntesis de ADNc o ARNc, el uso de nucleótidos modificados con biotina , que luego se tiñen con estreptavidina marcada con fluorescencia, el uso de nucleótidos modificados durante la síntesis, a los que luego se puede agregar una etiqueta fluorescente [ 14 ] .

El ADN o ARN marcado de esta manera se hibrida en un microchip y luego se lava. Se detecta una señal fluorescente en cada punto del chip. En el caso de muestras biotiniladas, la micromatriz de ADN se tiñe con marcadores fluorescentes que contienen estreptavidina después de la hibridación. La fluorescencia se excita con luz láser y se registra, por lo general, con un microscopio confocal de barrido [15] .

Análisis de unión del factor de transcripción

Los microarrays también se utilizan junto con la inmunoprecipitación de cromatina para identificar los sitios de unión del factor de transcripción ( TF) [16] [17] . Entonces el ADN se fragmenta. El TF deseado se aísla de la mezcla mediante cromatografía de afinidad utilizando anticuerpos o etiquetas que se insertan en este TF mediante métodos de ingeniería genética por adelantado. Después de la purificación, el ADN se libera de TF, se amplifica, se marca con fluorescencia y se usa para la hibridación en una micromatriz. Esta técnica se conoce comúnmente como "ChIP-chip" [18] , o inmunoprecipitación de cromatina en un chip, pero tiene limitaciones debido al hecho de que los TF pueden unirse lejos del gen que regulan.

Las micromatrices de ADN se utilizan ampliamente para detectar polimorfismos de un solo nucleótido ( SNP). Hay varios enfoques diferentes [15] :

Discriminación alélica

Las sondas cortas (25 nucleótidos para microarreglos de Affymetrix) que contienen todas las variantes de SNP en el centro se ubican en los microarreglos, ya que esta posición afecta más fuertemente la calidad de la hibridación. El ADN fragmentado, amplificado y marcado con fluorescencia de la muestra se aplica al microchip, donde tiene lugar la hibridación de la muestra y la sonda. En lugares de completa complementariedad de moléculas, se registra una fuerte señal [19] .

Análisis del "Puerta Dorada"

Este método se basa en la reacción en cadena de la polimerasa. Las moléculas complementarias al ADN genómico se colocan en la solución de ADN genómico y contienen varias modificaciones de SNP en el extremo 3' y varios cebadores en el extremo 5' para la PCR posterior , además, una molécula complementaria a otra hebra de ADN genómico se añade en el otro lado del SNP, que contiene en el extremo 5', otro cebador para PCR. La polimerasa se sintetizará solo a partir de ese cebador, cuyo extremo 3' corresponde al SNP. Como resultado, dependiendo de qué cebador con un extremo 3' modificado se utilice para la PCR, se observará tal SNP en la muestra [20] .

Extensión de imprimación

Aquí, las sondas se eligen de modo que cubran toda la región del ADN hasta el SNP, sin incluir el polimorfismo. El ADN genómico fragmentado se hibrida con un chip de este tipo, después de lo cual se añaden a la solución polimerasa y nucleótidos marcados con fluorescencia con 4 marcas diferentes en el extremo 3'. Dichos nucleótidos pueden unirse a la cadena existente mediante la polimerasa, pero luego no pueden unirse al siguiente nucleótido. Como resultado, las sondas se expanden en un nucleótido, lo que corresponde al SNP [21] .

Puntuación de nucleótidos externos

Este método es similar al método de extensión del cebador, con la diferencia de que las sondas no se ubican en un sustrato plano, sino en muchas perlas pequeñas. El SNP también se reconoce por el color de la única etiqueta de nucleótido completa [22] .

Restricciones

A pesar de las ventajas de los microarreglos de ADN, también tienen limitaciones en su aplicación. Se supone que la intensidad de la señal (brillo) registrada en un sitio particular de la micromatriz depende linealmente de la cantidad de ADN que se ha hibridado, lo que no siempre es así: debido a la cinética de hibridación, el nivel de señal obtenido en un punto dado no es una función lineal de la concentración de un ADN dado en la muestra. Por lo tanto, es posible estimar con precisión la cantidad de ADN en una muestra solo dentro de un cierto rango de concentraciones iniciales de ADN, que aún pueden proporcionar una relación lineal. La estimación de concentraciones inicialmente relativamente grandes o pequeñas de ADN de muestra será imprecisa [15] .

En los complejos genomas de los eucariotas, especialmente de los mamíferos, hay muchos genes homólogos, cuyas secuencias son muy similares, lo que impone condiciones adicionales al diseño de sondas para microarrays [23] [24] . Una sonda diseñada para un gen A también puede "atrapar" los genes B, C, D, que resultaron ser homólogos al gen A, lo que distorsionaría la imagen final.

Otra limitación está relacionada con el tamaño de la base de datos de genes conocidos. Es imposible sintetizar una sonda correspondiente a un gen desconocido y no se pueden detectar interacciones de tales genes. Este problema es especialmente relevante para los procariotas, ya que los genomas incluso de organismos estrechamente relacionados pueden diferir significativamente. Por ejemplo, en la especie bacteriana Aggregatibacter actinomycetemcomitans , los genomas de diferentes cepas pueden diferir en un 20% de los genes y, por lo tanto, los microarrays diseñados para una cepa no podrán detectar otra [25] .

Véase también

Notas

  1. ↑ Javier Garaizar, Aitor Rementeria, Steffen Porwollik. Tecnología de microarrays de ADN: ¿una nueva herramienta para la tipificación epidemiológica de patógenos bacterianos?  // FEMS inmunología y microbiología médica. - 2006-07-01. - T. 47 , n. 2 . - S. 178-189 . — ISSN 0928-8244 . -doi : 10.1111 / j.1574-695X.2006.00081.x . Archivado desde el original el 20 de abril de 2017.
  2. ↑ 1 2 3 4 5 M. Bednar. Tecnología y aplicación de microarrays de ADN  // Medical Science Monitor: International Medical Journal of Experimental and Clinical Research. - 2000-07-01. - T. 6 , núm. 4 . - S. 796-800 . — ISSN 1234-1010 . Archivado desde el original el 3 de abril de 2017.
  3. ↑ 1 2 Lashkari DA, DeRisi JL, McCusker JH, Namath AF, Gentile C., Hwang SY, Brown PO, Davis RW Microarrays de levadura para el análisis genético y de expresión génica en paralelo de todo el genoma  //  Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos Estados de América  : revista. - 1997. - vol. 94 . - Pág. 13057-13062 . -doi : 10.1073/ pnas.94.24.13057 . — PMID 9371799 .
  4. ↑ B. Alberts. Biología molecular de la célula: en 3 tomos.- 2013.- S. 881-885. - 2821 pág. - ISBN 978-0-8153-4111-6 . - ISBN 978-5-4344-0137-1 .
  5. ↑ Kulesh DA, Clive DR, Zarlenga DS, Greene JJ Identificación de secuencias de ADNc relacionadas con la proliferación modulada por interferón  // Actas de la Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos de América  : revista  . - 1987. - vol. 84 . - Pág. 8453-8457 . -doi : 10.1073/ pnas.84.23.8453 . —PMID 2446323 .
  6. ↑ Schena M., Shalon D., Davis RW, Brown PO Supervisión cuantitativa de patrones de expresión génica con una micromatriz de ADN complementaria  //  Science: revista. - 1995. - vol. 270 . - Pág. 467-470 . -doi : 10.1126 / ciencia.270.5235.467 . —PMID 7569999 .
  7. ↑ G. McGall, J. Labadie, P. Brock, G. Wallraff, T. Nguyen. Síntesis dirigida por la luz de matrices de oligonucleótidos de alta densidad utilizando fotoprotectores semiconductores  // Actas de la Academia Nacional de Ciencias  . - Academia Nacional de Ciencias de los Estados Unidos , 1996-11-26. — vol. 93 , edición. 24 . - Pág. 13555-13560 . — ISSN 0027-8424 . Archivado desde el original el 20 de abril de 2017.
  8. ↑ CF Edman, DE Raymond, DJ Wu, E. Tu, RG Sosnowski. Hibridación de ácidos nucleicos dirigida por campo eléctrico en microchips  // Investigación de ácidos nucleicos. — 1997-12-15. - T. 25 , n. 24 . - S. 4907-4914 . — ISSN 0305-1048 . Archivado desde el original el 20 de abril de 2017.
  9. ↑ Centro Nacional de Información Biotecnológica. MICROARRAYS: RESOLVIENDO LOS MISTERIOS DE LA CIENCIA Y LA MEDICINA . Consultado el 12 de abril de 2017. Archivado desde el original el 13 de abril de 2017.
  10. ↑ 1 2 3 4 5 6 7 Dan Tulpán. Patentes recientes y desafíos en tecnologías de diseño de sondas de micromatrices de ADN  // Patentes recientes en secuencias de genes y ADN. — 2010-11-01. - T. 4 , núm. 3 . - S. 210-217 . — ISSN 2212-3431 . Archivado desde el original el 18 de abril de 2017.
  11. ↑ Siun Chee Tan, Beow Chin Yiap. Extracción de ADN, ARN y proteínas: el pasado y el presente  // Journal of Biomedicine & Biotechnology. — 2009-01-01. - T. 2009 . - S. 574398 . — ISSN 1110-7251 . -doi : 10.1155 / 2009/574398 . Archivado desde el original el 24 de abril de 2017.
  12. ↑ Hagar Zohar, Susan J. Muller. Etiquetado de ADN para experimentos de una sola molécula: métodos de etiquetado de secuencias específicas internas en ADN de doble cadena  // Nanoescala. — 2011-08-01. - T. 3 , núm. 8 _ - S. 3027-3039 . — ISSN 2040-3372 . Archivado desde el original el 24 de abril de 2017.
  13. ↑ Marco Wiltgen, Gernot P.Tilz. Análisis de micromatrices de ADN: principios e impacto clínico  // Hematología (Ámsterdam, Países Bajos). - 2007-08-01. - T. 12 , n. 4 . - S. 271-287 . — ISSN 1607-8454 . -doi : 10.1080/ 10245330701283967 . Archivado desde el original el 24 de abril de 2017.
  14. ↑ pubmeddev. Comparación de métodos de marcaje de ADN con etiquetas fluorescentes utilizados para la expresión - PubMed - NCBI  . www.ncbi.nlm.nih.gov. Fecha de acceso: 13 de abril de 2017.
  15. ↑ 1 2 3 Roger Bumgarner. Descripción general de los microarreglos de ADN: tipos, aplicaciones y su futuro  //  Protocolos actuales en biología molecular. — 2013-01-01. — vol. capitulo 22 — P. Unidad 22.1. . — ISSN 1934-3647 . -doi : 10.1002/ 0471142727.mb2201s101 . Archivado desde el original el 19 de abril de 2017.
  16. ↑ M. J. Solomon, P. L. Larsen, A. Varshavsky. Mapeo de interacciones proteína-ADN in vivo con formaldehído: evidencia de que la histona H4 se retiene en un  gen altamente transcrito  // Cell . - Prensa celular , 1988-06-17. — vol. 53 , edición. 6 _ - Pág. 937-947 . — ISSN 0092-8674 .
  17. ↑ Christine E. Horak, Michael Snyder. ChIP-chip: un enfoque genómico para identificar los sitios de unión del factor de transcripción  // Métodos en Enzimología. - 2002-01-01. - T. 350 . - S. 469-483 . — ISSN 0076-6879 .
  18. ↑ Michael J. Buck, Jason D. Lieb. ChIP-chip: consideraciones para el diseño, análisis y aplicación de experimentos de inmunoprecipitación de cromatina en todo el genoma  // Genómica . - Prensa Académica , 2004-03-01. - T. 83 , n. 3 . - S. 349-360 . — ISSN 0888-7543 .
  19. ↑ DG Wang, JB Fan, CJ Siao, A. Berno, P. Young. Identificación, mapeo y genotipado a gran escala de polimorfismos de un solo nucleótido en el genoma humano  // Science (Nueva York, NY). — 1998-05-15. - T. 280 , n. 5366 . — ISSN 0036-8075 . Archivado desde el original el 19 de abril de 2017.
  20. ↑ JB Fan, A. Oliphant, R. Shen, BG Kermani, F. García. Genotipado de SNP altamente paralelo  // Simposio de Cold Spring Harbor sobre biología cuantitativa. - 2003-01-01. - T. 68 . - S. 69-78 . — ISSN 0091-7451 . Archivado desde el original el 19 de abril de 2017.
  21. ↑ A. Kurg, N. Tõnisson, I. Georgiou, J. Shumaker, J. Tollett. Extensión de cebadores en matriz: tecnología de detección de mutaciones y resecuenciación de ADN de cuatro colores en fase sólida  // Pruebas genéticas. — 2000-01-01. - T. 4 , núm. 1 . - S. 1-7 . — ISSN 1090-6576 . -doi : 10.1089/ 109065700316408 . Archivado desde el original el 19 de abril de 2017.
  22. ↑ Kevin L. Gunderson, Frank J. Steemers, Hongi Ren, Pauline Ng, Lixin Zhou. Genotipado del genoma completo  // Métodos en Enzimología. - 2006-01-01. - T 410 . - S. 359-376 . — ISSN 0076-6879 . - doi : 10.1016/S0076-6879(06)10017-8 .
  23. ↑ Paul J. Gardina, Tyson A. Clark, Brian Shimada, Michelle K. Staples, Qing Yang. Empalme alternativo y expresión génica diferencial en el cáncer de colon detectado por una matriz de exones del genoma completo  // Genómica BMC. — 2006-12-27. - T. 7 . - art. 325 . — ISSN 1471-2164 . -doi : 10.1186 / 1471-2164-7-325 . Archivado desde el original el 23 de abril de 2017.
  24. ↑ John Castle, Phil Garrett-Engele, Christopher D. Armour, Sven J. Duenwald, Patrick M. Loerch. Optimización de matrices de oligonucleótidos y protocolos de amplificación de ARN para el análisis de la estructura de la transcripción y empalme alternativo  //  BioMed Central. - 2003-01-01. — vol. 4 , edición. 10 _ — P.R66 . — ISSN 1474-760X . -doi : 10.1186 / gb-2003-4-10-r66 . Archivado desde el original el 23 de abril de 2017.
  25. ↑ Weerayuth Kittichotirat, Roger E. Bumgarner, Sirkka Asikainen, Casey Chen. Identificación del pangenoma y sus componentes en 14 cepas distintas de Aggregatibacter actinomycetemcomitans mediante análisis genómico comparativo  // PloS One. — 2011-01-01. - T. 6 , núm. 7 . — S. e22420 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0022420 . Archivado desde el original el 23 de abril de 2017.
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