Una unidad formadora de colonias (abbr. CFU ) es una unidad que evalúa la cantidad de células microbianas ( bacterias , hongos , virus , etc.) en una muestra que son viables y capaces de multiplicarse por división en condiciones controladas. El recuento de unidades formadoras de colonias requiere cultivar microorganismos y contar solo células viables, en contraste con el examen microscópico, que cuenta todas las células, vivas o muertas. El recuento visual de colonias en un cultivo celular después de la siembra solo es posible después de la formación de colonias grandes y, al contarlas, es posible que no quede claro si se originó en una sola célula o en un grupo de células. Expresar los resultados como unidades formadoras de colonias puede eliminar esta incertidumbre.
El propósito del recuento en placa es estimar el número de células presentes en función de su capacidad para formar colonias en determinadas condiciones de medios, temperatura y tiempo. En teoría, una célula viable puede dar lugar a una colonia por replicación. Sin embargo, las células individuales son una excepción y, con mayor frecuencia, el progenitor de una colonia es un grupo de células que existen juntas. Además, muchas bacterias crecen en cadenas (p. ej ., Streptococcus ) o grupos (p. ej ., Staphylococcus ). Por estas razones, la estimación del número de microbios que utilizan CFU en la mayoría de los casos es menor que el número real de células vivas individuales presentes en la muestra. El recuento de UFC supone que cada colonia está separada y se basa en una única célula microbiana viable [1] .
Por ejemplo, el recuento de UFC para E. coli por el método de la placa es lineal en el rango de 30 a 300 unidades en una placa de Petri de tamaño estándar [2] . Por lo tanto, para garantizar que una muestra produzca CFU en este rango, se requieren diluciones en serie de varios cultivos. Como regla general, se utilizan diluciones de diez veces y se siembra una serie de diluciones en dos o tres repeticiones en el rango de diluciones seleccionado. A menudo se inoculan 100 µl de la mezcla, pero también se utilizan cantidades mayores (hasta 1 ml ) . Los volúmenes de recubrimiento más grandes aumentan el tiempo de secado, pero a menudo no dan como resultado una mayor precisión, ya que pueden requerirse pasos de dilución adicionales [3] . A continuación, las colonias se cuentan en un rango lineal, y luego se derivan matemáticamente las proporciones de CFU/ g (o CFU/ml) en la mezcla inicial, teniendo en cuenta la cantidad aplicada y su factor de dilución.
Una mezcla con una concentración desconocida conocida de microorganismos a menudo se diluye en serie para obtener al menos una placa con un número contable de colonias. La ventaja de este método es que diferentes tipos de microorganismos pueden producir colonias que son claramente diferentes entre sí tanto microscópica como macroscópicamente. La morfología de las colonias puede ser muy útil para identificar los microorganismos presentes.
Un examen preliminar de la morfología de la colonia del microorganismo puede proporcionar una mejor comprensión de cómo se relacionan las CFU/ml observadas con el número de células viables por mililitro. Alternativamente, en algunos casos, el número promedio de células por CFU puede reducirse agitando la muestra antes de diluirla. Sin embargo, muchos microorganismos son demasiado sensibles a la agitación y la proporción de células viables puede disminuir cuando se colocan en una placa de Petri.
Las concentraciones de unidades formadoras de colonias se pueden expresar tanto en términos absolutos como en términos logarítmicos, donde el valor es el logaritmo en base 10 de la concentración .
El recuento de colonias se realiza tradicionalmente de forma manual con un bolígrafo y un contador de clics. Por lo general, esta es una tarea simple, pero puede volverse muy laboriosa y consumir mucho tiempo si hay muchas muestras para calcular. Alternativamente, se pueden utilizar soluciones semiautomáticas (software) y automáticas (hardware y software).
Las colonias se pueden numerar a partir de fotografías de placas de muestra utilizando herramientas de software. Para ello, se suele fotografiar cada placa de Petri y luego se analizan todas las imágenes. Esto se puede hacer con una simple cámara digital o incluso con una cámara web. Dado que por lo general toma menos de 10 segundos adquirir una sola imagen, en comparación con varios minutos para el conteo manual de CFU, este enfoque generalmente ahorra mucho tiempo. También es más objetivo y te permite extraer otras variables como el tamaño y el color de la colonia.
Además del software para PC , hay aplicaciones disponibles para dispositivos Android e iOS para el recuento de colonias automático y semiautomático. La cámara integrada se usa para fotografiar la placa de agar y un algoritmo interno o externo procesa los datos de la imagen y estima el número de colonias [9] [10] [11] .
Los sistemas automatizados se utilizan para contrarrestar el error humano, ya que muchos de los métodos de recuento de células humanas tienen una alta probabilidad de error. Debido a que los investigadores cuentan manualmente las células de forma rutinaria utilizando luz transmitida, este método propenso a errores puede tener un impacto significativo en la concentración calculada en el medio líquido inicial, especialmente cuando las células se encuentran inicialmente en una baja concentración en la mezcla.
Algunos fabricantes de biotecnología también ofrecen sistemas totalmente automatizados [12] . Tienden a ser costosos y no tan flexibles como el software independiente, ya que el hardware y el software están diseñados para trabajar juntos en una configuración específica.
Algunos sistemas automatizados, como los sistemas MATLAB, permiten contar las células sin necesidad de tinción. Esto permite reutilizar las colonias para otros experimentos sin el riesgo de destruir las colonias de microorganismos. Sin embargo, la desventaja de estos sistemas automatizados es que es extremadamente difícil distinguir las colonias de las acumulaciones de polvo o los rasguños en las placas de agar sangre, porque tanto el polvo como los rasguños pueden crear una amplia variedad de combinaciones de formas y apariencias [13] .
En lugar de unidades formadoras de colonias, puede usar los parámetros "Número más probable" (ing. Número más probable, MPN), así como Unidades Fishman Modificadas (MFU). El método del número más probable cuenta las células viables, lo cual es útil cuando se cuentan bajas concentraciones de células o cuando se cuentan microorganismos contenidos en productos en los que las partículas extrañas hacen que el recuento en placas de Petri sea poco práctico. Las unidades Fishman modificadas también tienen en cuenta los microorganismos que son viables pero que no se cultivan por ningún motivo.