El método Sanger es un método de secuenciación de ADN , también conocido como método de terminación de cadena. Este método de secuenciación fue propuesto por primera vez por Frederick Sanger en 1977 [1] , por lo que recibió el Premio Nobel de Química en 1980. Este método ha sido el más común durante 40 años.
En la versión clásica del método Sanger, una de las hebras del ADN analizado actúa como molde para la síntesis de una hebra complementaria por la enzima ADN polimerasa . La reacción con la misma matriz se lleva a cabo en cuatro tubos diferentes, cada uno de los cuales contiene:
Los didesoxirribonucleótidos (ddATP, ddGTP, ddCTP o ddTTP) carecen de un grupo 3'-hidroxilo, por lo que la síntesis posterior se interrumpe después de su inclusión en la cadena. Así, en cada tubo se forma un conjunto de fragmentos de ADN de diferente longitud, que terminan en el mismo nucleótido (según el didesoxinucleótido añadido). Una vez completada la reacción, el contenido de los tubos se separa mediante electroforesis en gel de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes y los geles se autorradiografian . Los productos de cuatro reacciones forman una "escalera de secuenciación", que permite "leer" la secuencia de nucleótidos de un fragmento de ADN [2] [1] .
El método de Sanger también le permite determinar la secuencia de nucleótidos del ARN , pero primero debe ser "reescrito" en forma de ADN mediante transcripción inversa .
Hasta la fecha, la secuenciación del ADN según Sanger está completamente automatizada y se lleva a cabo en dispositivos especiales, secuenciadores. El uso de didesoxinucleótidos con etiquetas fluorescentes con diferentes longitudes de onda de emisión permite realizar la reacción en un solo tubo de ensayo. La mezcla de reacción se separa por electroforesis capilar en solución, los fragmentos de ADN que emergen de la columna capilar se registran mediante un detector de fluorescencia . Los resultados se analizan por computadora y se presentan como una secuencia de picos coloreados correspondientes a cuatro nucleótidos. Los secuenciadores de este tipo pueden "leer" a la vez secuencias de 500-1000 nucleótidos de longitud. En comparación, el método de pirosecuenciación , desarrollado en 1996, permite un paso para determinar la secuencia de un número mucho menor de nucleótidos. La automatización ha acelerado enormemente el proceso de secuenciación y ha permitido la secuenciación de genomas completos , incluido el genoma humano [2] .