El método de tinción de Ziehl-Nielsen (según Ziehl-Nelsen [1] ) es un método de tinción de microorganismos para detectar micobacterias resistentes a los ácidos (agentes causantes de tuberculosis , micobacteriosis , lepra ), actinomicetos y otros microorganismos resistentes a los ácidos . La resistencia a los ácidos de los microorganismos se debe a la presencia de lípidos , ceras e hidroxiácidos en sus células . Dichos microorganismos se tiñen mal con soluciones de tinte diluidas. Para facilitar la penetración del tinte en las células de los microorganismos, la fucsina carbólica Tsilya aplicada a la preparación se calienta sobre la llama de un quemador. Los microorganismos coloreados no se decoloran con soluciones débiles de ácidos minerales y alcohol.
El método lleva el nombre de médicos alemanes: el microbiólogo Franz Ziel y el patólogo Friedrich Nelsen ( Nielsen), quienes lo desarrollaron en 1882-1883 .
disolver 0,3 g de cloruro de azul de metileno en 100 ml de agua destilada.
Cuando se tiñen con este método, las bacterias resistentes a los ácidos se vuelven intensamente rojas , el resto de la microflora se tiñe de azul claro [3] .
Las Mycobacterium tuberculosis resistentes a los ácidos tienen aproximadamente 1-10 micrones de largo y 0,2-0,6 micrones de ancho. Por lo general, se ven en forma de delgados y elegantes palos, pero a veces puedes encontrar opciones curvas o retorcidas. Cuando se tiñe con fucsina carbólica , Mycobacterium tuberculosis se detecta como bastoncillos de color rojo frambuesa, ligeramente curvados y delgados que contienen un número variable de gránulos. Los microorganismos, ubicados individualmente, en parejas o en grupos, se destacan bien sobre el fondo azul de otros componentes de la droga. No es raro que las células bacterianas formen un número romano "V".
Dentro de las células microbianas individuales, se pueden encontrar áreas de tinción más intensa, lo que da como resultado una apariencia de "perlas", mientras que las áreas de tinción más débil se pueden ver como "rayas". En la preparación, también se pueden detectar formas alteradas resistentes a los ácidos similares a cocos del patógeno, estructuras esféricas redondeadas o similares a micelio. Sin embargo, en caso de detección de formas alteradas de microorganismos resistentes a los ácidos, se debe confirmar una respuesta positiva mediante métodos de investigación adicionales.
Algunos otros microorganismos, no relacionados con M.tuberculosis , pueden tener varias formas, desde palos largos hasta formas cocoides con intensidad de tinción variable. Se pueden observar diversos grados de coloración acidorresistente no solo en las micobacterias, sino también en otros microorganismos. Estos pueden ser Rhodococcus , Nocardia, Legionella , así como Quistes de Cryptosporidium e Isospora . Las micobacterias de crecimiento rápido pueden diferir en el grado de color ácido-resistente: con una pérdida parcial del color ácido-resistente, adquieren un color carmesí púrpura.
En un estudio cultural, la respuesta sobre el aislamiento de micobacterias acidorresistentes se da solo después de una microscopía de un frotis teñido con Ziehl-Neelsen de colonias cultivadas. Al preparar frotis para el examen microscópico, las colonias de Mycobacterium tuberculosis muestran sus características físicas y químicas: no se emulsionan en una solución isotónica, sino que forman una suspensión granular que se desmenuza. Esto se debe a la presencia en la composición de su pared celular de una gran cantidad de sustancias hidrofóbicas de cera grasa. El examen microscópico de frotis de colonias cultivadas, teñidas de acuerdo con Ziehl-Nelsen, revela bacterias en forma de bastoncillos de color rojo carmesí brillante que se encuentran solas o en grupos, formando racimos o tejidos en forma de "fieltro" o "trenzas". Las micobacterias de la tuberculosis se ven como bastones delgados, rectos o ligeramente curvados, de 1–10 (generalmente 1–4) µm de largo, 0,2–0,6 µm de ancho, homogéneos o granulares con extremos ligeramente redondeados. Más a menudo en la preparación, especialmente en cultivos de crecimiento prolongado, son visibles acumulaciones de granos de color oscuro. En cultivos jóvenes, especialmente aislados de pacientes tratados durante mucho tiempo con fármacos antituberculosos, las micobacterias se caracterizan por un alto polimorfismo, hasta la aparición de formas cortas, casi cocoides.
El examen microscópico de un frotis debe examinar al menos 100 campos de visión para cuantificar el fármaco y detectar micobacterias individuales. En el caso de que el resultado de dicho estudio resulte negativo, se ven 200 campos de visión adicionales para confirmar. Con un número significativo de micobacterias resistentes a los ácidos, es suficiente examinar 20-50 campos de visión tanto con tinción de Ziehl-Neelsen como con microscopía de fluorescencia (ver tabla ). Durante el examen microscópico de la preparación, es necesario asegurarse de que no se vea repetidamente ningún campo de visión de la preparación, por lo que se recomienda observar la preparación siempre de acuerdo con el mismo esquema:
Comienzan a ver la preparación desde el campo de visión superior izquierdo seleccionado en el frotis, moviéndose gradualmente a lo largo del eje longitudinal de la preparación hasta el final del frotis, o moviéndose hacia abajo y luego subiendo de nuevo, etc., pasando por todos campos de visión hasta el borde del frotis. Con un aumento de microscopio de 1000x, es decir, 100x para un objetivo de inmersión en aceite y 10x para un ocular, cuando se examina una longitud de trazo (~ 20 mm), se ven alrededor de 100-120 campos de visión en un pase longitudinal (diámetro de campo - 0,16 - 0,2 mm).
| resultado de la investigación | Número mínimo de campos de visión (p/s) | Formulario de registro de resultados | Interpretación de los resultados del estudio |
|---|---|---|---|
| AFB [4] no detectado en 300 p/s | 300 | OTR. | Negativo |
| 1 - 2 KUM en 300 p / s | 300 | Se recomienda repetir el estudio. | El resultado no se evalúa. |
| 1 - 9 KUM en 100 p / s | 100 | "_N__" KUM en 100 p/s [5] | Positivo |
| 10 - 99 KUM en 100 p / s | 100 | 1+ [6] | Positivo |
| 1 - 10 KUM en 1 p / s | cincuenta | 2+ [6] | Positivo |
| Más de 10 KUM en 1 p/s | veinte | 3+ [6] | Positivo |