Cromatografía de fase inversa
La cromatografía de fase reversa (fase inversa) (RPC) es una variante de la cromatografía en la que la fase estacionaria no es polar [1] . Esta variante de cromatografía se refiere a la cromatografía líquida (a diferencia de la cromatografía de gases).
El término "fase reversa" tiene antecedentes históricos. En la década de 1970, la cromatografía líquida en la mayoría de los casos usaba una fase estacionaria sólida (también llamada " columna ") que contenía rellenos de aluminio o silicio sin modificar. Hoy este método se conoce como "cromatografía de fase normal". En el caso de la cromatografía en fase normal, la fase estacionaria es hidrófila (tiene una gran afinidad por las moléculas hidrófilas de la fase móvil). Por lo tanto, las moléculas hidrofílicas en la fase móvil tienden a unirse ( adsorberse ) en la columna, mientras que las hidrofóbicaslas moléculas pasan a través de la columna y se eluyen primero. En la cromatografía de fase normal, las moléculas hidrófilas se pueden eluir de la columna aumentando la polaridad de la solución de fase móvil.
El advenimiento de métodos que utilizan cadenas de alquilo unidas covalentemente a una base sólida hizo posible crear una fase estacionaria hidrofóbica con una fuerte afinidad por los compuestos hidrofóbicos. El uso de una fase estacionaria hidrofóbica puede verse como lo opuesto o "inverso" de la cromatografía de fase normal; de ahí el término "cromatografía de fase inversa" [2] [3] . La cromatografía de fase inversa utiliza una fase móvil polar (acuosa). Como resultado, las moléculas hidrófobas de la fase móvil polar se adsorben en la fase estacionaria hidrófoba, mientras que las moléculas hidrófilas de la fase móvil pasarán a través de la columna y serán eluidas primero [2] [4] . Las moléculas hidrofóbicas se pueden eluir de la columna al disminuir la polaridad de la fase móvil usando solventes orgánicos (no polares) que reducen las interacciones hidrofóbicas. Cuanto más hidrófoba sea una molécula, más se unirá a la fase estacionaria y mayor será la concentración de disolvente orgánico que se requerirá para eluir esa molécula.
Muchas de las suposiciones matemáticas y experimentales utilizadas en otros métodos cromatográficos también se aplican en OFC (p. ej., la "resolución de separación" depende de la longitud de la columna). También se puede utilizar para separar muchos tipos de moléculas. Este método no se usa comúnmente para separar proteínas porque los solventes orgánicos usados pueden desnaturalizar la mayoría de las proteínas. Por lo tanto, en este caso, la cromatografía en fase normal es un método más aceptable.
Hoy OFC se utiliza a menudo con fines analíticos. Hay varias fases estacionarias diferentes para RPC, lo que permite una mayor flexibilidad en la elección de los métodos de separación.
Fase estacionaria (estacionaria)
Tabla 1. Principales fases estacionarias utilizadas en HPLC de fase inversa [5] [6] .| Designacion | Descripción | Estructura |
|---|---|---|
| C1, TMS, SAS, trimetilo | Tiene alta selectividad en la separación de compuestos polares y compuestos con un gran número de grupos funcionales. Retiene menos compuestos con grupos alquilo en disolventes no polares. | |
| C2, RP-2, dimetilo | Tiene una retención mayor que C1 y menor que C4, C8 y C18. | |
| C3, propilo | Utilizado en cromatografía de interacción hidrofóbica ( HIC ) de péptidos y proteínas. | |
| C4, butilo | Aplicable para HIC y cromatografía de pares iónicos. En disolventes no polares tiene una retención menor que las fases C8 y C18. Este material con un diámetro de poro de 300 Å es ideal para el análisis de proteínas grandes y péptidos hidrofóbicos. | |
| C5, Lápiz | Con un diámetro de poro de 300 Å, se utiliza para la separación en fase inversa de proteínas y péptidos hidrofóbicos. Más resistente a la hidrólisis que C4. | |
| C6, hexilo | Se utiliza para la cromatografía de pares de iones. Tiene menor retención que C8 y C18. | |
| C8, MOS, RP-8, LC8, octilo | Está cerca de C18 en selectividad, pero tiene una retención más baja. Ampliamente utilizado en el análisis de fármacos, nucleótidos, esteroides, etc. Con un diámetro de poro de 300 Å, este material es muy adecuado para la separación de péptidos y proteínas hidrofílicas pequeñas. | |
| C12, dodecilo | Debido a la cadena de carbono más corta que C18, proporciona una buena interacción y una forma de pico más nítida para compuestos no polares y moderadamente polares. | |
| C18, SAO, RP-18, LC-18, Octadecilo | El clásico material de fase inversa con la mayor retención en disolventes no polares. Funciona muy bien en cromatografía de par de iones. Tiene la más amplia gama de aplicaciones (separación de péptidos, nucleósidos, nucleótidos, esteroides, fármacos, vitaminas, ácidos grasos, pesticidas, etc.). Con un diámetro de poro de 300 Å, este material se utiliza para separar pequeños péptidos hidrofóbicos. | |
| C 6 H 5 , Fenilo | Tiene una selectividad única y se utiliza para separar compuestos aromáticos. Con un diámetro de poro de 300 Å, este material se utiliza para HIC. | |
| C 6 H 5 ( enlazador C 3 H 6 O ), éter fenilo | Se utiliza para separar aromáticos altamente polares. Difiere en selectividad de las fases de fenilo y fenilhexilo. | |
| C 6 H 5 ( enlazador C 6 H 12 ), fenil-hexilo | Tiene la misma selectividad que la fase fenílica, pero con una estabilidad mucho mayor. | |
| C 6 F 5 , PFP | Utilizado para el análisis de compuestos aromáticos sustituidos. Difiere en selectividad de las fases fenil-hexilo, fenilo clásico y alquilo. | |
| CN, CPS, PCN, ciano, cianopropilo, nitrilo | Se puede utilizar como material de fase reversa o fase normal. Al ser ligeramente polar, esta fase tiene una excelente selectividad en la separación de compuestos polares. Además, se equilibra rápidamente, lo cual es una propiedad valiosa a la hora de trabajar .
en modo de elución en gradiente. Se utiliza para el análisis de diversos productos farmacéuticos (por ejemplo, antidepresivos, etc.) |
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| NH 2 , APS, amino, aminopropilsililo | Se puede utilizar para cromatografía de fase inversa, fase normal y de intercambio iónico (intercambiador aniónico débil). Se utiliza en cromatografía de fase inversa para separar carbohidratos. | |
| OH, diol, glicerol | Se puede utilizar como material de fase reversa o fase normal. Cuando trabaja en fase reversa, se utiliza en cromatografía de filtración en gel (GFC) de péptidos y proteínas. |
Fase móvil
Para eluir los analitos de una columna de fase inversa, se utilizan mezclas de agua o soluciones tampón acuosas y disolventes orgánicos [2] . Los disolventes orgánicos deben ser miscibles con agua. Los más comunes son el acetonitrilo , el metanol y el tetrahidrofurano (THF). También es posible utilizar etanol o isopropanol . La elución se puede llevar a cabo de forma isocrática (la mezcla de agua y disolvente orgánico no cambia de porcentaje durante todo el proceso de separación), o utilizando un gradiente (la relación agua-disolvente orgánico cambia durante el proceso, normalmente en la dirección de polaridad decreciente). El valor de pH de la fase móvil puede tener una gran influencia en la separación de la mezcla y también puede cambiar la selectividad del análisis (el orden de liberación de los compuestos analizados).
Los analitos cargados se pueden separar en una columna de fase inversa usando pares de iones (también: interacción de iones). Esta técnica se conoce como "Cromatografía de par de iones de fase inversa".
Notas
- ↑ Edición de Internet del Libro Dorado de la IUPAC : " cromatografía de fase inversa ".
- ↑ 1 2 3 Akul Mehta. Principio de cromatografía de fase inversa HPLC/UPLC (con animación ) . PharmaXChange (27 de diciembre de 2012). Consultado el 10 de enero de 2013. Archivado desde el original el 15 de abril de 2013.
- ↑ I Molnár y C Horvath. Cromatografía de fase inversa de sustancias biológicas polares: separación de compuestos de catecol por cromatografía líquida de alta resolución (inglés) // Clinical Chemistry: revista. - 1976. - Septiembre ( vol. 22 , núm. 9 ). - P. 1497-1502 . — PMID 8221 .
- ↑ (Bioquímica clínica, TWHrubey, 54)
- ↑ Fenómeno. Fases ligadas de HPLC . http://www.phenomenex.com . Consultado el 3 de septiembre de 2017. Archivado desde el original el 3 de septiembre de 2017.
- ↑ Aquilón. Una breve guía de HPLC . www.akvilon.su_ _
Enlaces
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