Secuenciación de biopolímeros ( proteínas y ácidos nucleicos - ADN y ARN ) - determinación de su secuencia de aminoácidos o nucleótidos (del latín sequentum - secuencia). Como resultado de la secuenciación, se obtiene una descripción formal de la estructura primaria de una macromolécula lineal en forma de secuencia de monómeros en forma de texto. Los tamaños de los segmentos de ADN que se van a secuenciar no suelen superar los 100 pares de bases (secuenciación de próxima generación) y los 1000 pares de bases para la secuenciación de Sanger. Como resultado de la secuenciación de secciones de ADN superpuestas, se obtienen secuencias de secciones de genes, genes completos, ARNm total o genomas completos de organismos [1] [2] .
Para la secuenciación se utilizan los métodos de Edman , Sanger y otros; actualmente, el método de Sanger con trifosfatos de dideoxinucleósido ( ddNTP ) se usa comúnmente para la secuenciación de genes. Normalmente, antes de la secuenciación, la sección de ADN a secuenciar se amplifica mediante PCR . La secuenciación del genoma completo generalmente se lleva a cabo utilizando tecnologías de secuenciación de próxima generación .
El método didesoxinucleótido, o método de “terminación de cadena”, fue desarrollado por F. Sanger en 1977 y actualmente se usa ampliamente para determinar la secuencia de nucleótidos del ADN. La secuenciación de Sanger hibrida un oligonucleótido sintético de 17 a 20 nt de largo con un sitio específico en una de las cadenas del sitio secuenciado. Este oligonucleótido es un cebador que proporciona un grupo 3'-hidroxilo para iniciar la síntesis de una cadena complementaria al molde.
La solución de cebador se divide en cuatro tubos, cada uno con cuatro desoxinucleótidos, dATP, dCTP, dGTP y dTTP (uno de los cuales está radiomarcado) y uno de los cuatro 2',3'-didesoxinucleótidos (ddATP, ddTTP, ddGTP o ddCTP) . El didesoxinucleótido se incluye en todas las posiciones en la mezcla de cadenas en crecimiento y, después de su unión, el crecimiento de la cadena se detiene inmediatamente.
Como resultado, en cada uno de los cuatro tubos de ensayo, con la participación de la ADN polimerasa , se forma un conjunto único de oligonucleótidos de diferentes longitudes, incluida la secuencia del cebador. Además, se añade formamida a los tubos de ensayo para separar las cadenas y se lleva a cabo una electroforesis en un gel de poliacrilamida en cuatro carriles. Realice una autorradiografía , que le permite "leer" la secuencia de nucleótidos del segmento de ADN secuenciado.
En una versión más moderna, los didesoxinucleótidos se marcan con cuatro colorantes fluorescentes diferentes y la PCR se realiza en un tubo. Luego, durante la electroforesis en gel de poliacrilamida, un rayo láser en un punto determinado del gel excita la fluorescencia de los tintes y el detector determina qué nucleótido está migrando actualmente a través del gel. Los instrumentos modernos utilizan la electroforesis capilar para la secuenciación del ADN . [3]
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