Tsien, Roger

roger tsen
inglés  roger tsen
Fecha de nacimiento 1 de febrero de 1952( 1952-02-01 ) [1] [2] [3] […]
Lugar de nacimiento
Fecha de muerte 24 de agosto de 2016( 2016-08-24 ) [1] [2] [3] […] (64 años)
Un lugar de muerte
País
Esfera científica bioquímica
Lugar de trabajo Universidad de California en Berkeley
Universidad de California en San Diego
alma mater Universidad de Harvard Universidad de
Cambridge
consejero científico Richard Adrian
Jeremy Sanders
Premios y premios premio lobo icon.png Premio Wolf de Medicina (2004) Premio Nobel de Química ( 2008 )
premio Nobel
Sitio web tsienlab.ucsd.edu
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Roger Tsien ( Roger Qian , inglés  Roger Tsien , chino 钱永健, pinyin Qián Yǒngjiàn , pall. Qian Yongjian [4] ; 1 de febrero de 1952  - 24 de agosto de 2016 ) - químico estadounidense de origen chino, profesor del Departamento de Química y Universidad de Bioquímica de California en San Diego [5] . En 2008 fue galardonado con el Premio Nobel de Química "por el descubrimiento y trabajo sobre la proteína verde fluorescente " junto con otros dos químicos [6] .

Biografía

Primeros años

Roger Yongchin Tsien nació en Nueva York el 1 de febrero de 1952, el menor de tres hijos, hijo de Xuezhu Tsien, ingeniero mecánico del Instituto Tecnológico de Massachusetts, y la enfermera Ying. La ascendencia de su familia está conectada a una línea de eruditos nobles de Hangzhou , con una larga relación históricamente documentada con la dinastía Song . Además, la familia tuvo un destino inusual, que refleja los acontecimientos históricos chinos durante e inmediatamente después de la Segunda Guerra Mundial. Sus representantes a menudo hicieron carrera en Occidente, a pesar de los fracasos y los prejuicios. Entonces, Qian Xuesen , uno de los fundadores del Laboratorio de Propulsión a Chorro en el Instituto de Tecnología de California , es primo del padre de Tsien. El hermano de Tsien, Richard, también es un erudito de renombre en Stanford. Roger dijo una vez:

“Nací para este trabajo”.

El padre de Roger era propietario de una pequeña empresa comercial en Nueva York y también trabajaba como consultor de ingeniería en el condado de Westchester. Luego, su padre trasladó a la familia a Livingston, Nueva Jersey, cuando Roger tenía ocho años. Allí, mi padre trabajó en tubos de vacío y productos petroquímicos para Radio Corporation of America y Esso Research and Engineering.

Cuando era niña, Tsien sufría de asma y, por lo tanto, pasaba mucho tiempo en el interior. Mostró habilidades inusualmente altas para el conocimiento científico, que luego se convirtió en un amor por la química teórica y práctica. Como era de esperar, esto comenzó con un interés en el comportamiento de los cromóforos mediado por ligandos (  las transiciones de color de los iones metálicos involucradas en una amplia gama de experimentos clásicos en química inorgánica) y se manifestó de manera más prominente en los intentos de sintetizar ácido acetilsalicílico , a menudo en el patio trasero. en platos caseros y con instrumentos improvisados. Roger recibió su primera insignia de Boy Scout por sus servicios en el campo de la química. Su cuaderno, en el que anotó sus experimentos químicos cuando tenía ocho años, se conserva ahora en el Museo Nobel de Estocolmo [7] .

Años escolares

El talento para la química y el amor por ella permanecieron con el joven Roger en sus años escolares. Completó un programa de investigación de verano en la Universidad de Ohio en 1967 con el apoyo de la Fundación Nacional de Ciencias. El estudio se centró en las propiedades ambientales del tiocianato (SCN - ) derivadas de la distribución de carga negativa similar entre los átomos nucleófilos de azufre y nitrógeno. Esta distribución de carga simétrica sugirió la posibilidad de formar un enlace conectando dos o más iones metálicos mediante la unión de un átomo de N y S a metales de clase A y B, respectivamente. A pesar de que este trabajo no complació a Roger e incluso lo molestó, la investigación recibió el premio más alto en 1968 como parte de la competencia Westinghouse Science Talent Search, cuando tenía 16 años [7] .

Desarrollo de la carrera de investigación

Roger luego va a Harvard , donde su interés en la química fue interrumpido por las artes liberales de la universidad. En la universidad, Tsien conoció a Walter Gilbert en cursos de biología molecular, Jack Nichols, David Hubel (miembro extranjero de la Royal Society of London, 1982) y Torsten Wiesel (miembro extranjero de la Royal Society of London, 1982) en cursos de neurofisiología. de los sistemas visuales, y con Nelson Kiang en conferencias sobre la neurofisiología de los sistemas auditivos. Roger se unió a Phi Beta Kappa en química y física en 1972, graduándose summa cum laude (cum laude) de Harvard con el Premio Detur. El consejo de los maestros mencionados anteriormente llevó a Roger a calificar con éxito para una beca Marshall que cubre un programa de doctorado en el Laboratorio de Fisiología de Churchill College, Universidad de Cambridge .

El director de su proyecto de doctorado en Cambridge, el profesor Richard Adrian estaba interesado en la fisiología celular de la activación del músculo esquelético ; ella y Tsien se hicieron amigas. Adrian estaba más interesado en dar a los estudiantes de alto calibre intelectual y científico la oportunidad de desarrollar sus aspiraciones originales y su independencia que en reclutar subordinados que trabajaran diligentemente y sin cuestionamientos bajo la dirección del investigador principal. Este fue generalmente el caso en el laboratorio fisiológico fundado por Hill en 1965.

En el enfoque científico, Tsien heredó el compromiso de Adrian con el trabajo de laboratorio y las estrechas relaciones con un pequeño número de colegas que tenían cualidades excepcionales en un pequeño grupo de investigación. Supervisor y estudiante se apoyaron mutuamente: años después de graduarse, Roger se mantuvo en contacto con su mentor hasta el final de la vida de este último.

El estudiante no se sintió atraído por los métodos electrofisiológicos disponibles (métodos para registrar las características de la respuesta extracelular en neuronas individuales dentro de una gran población del sistema nervioso central) utilizados en el trabajo, aunque solo fuera por sus respuestas a estímulos sensoriales simples. Tuvo largas conversaciones con Richard Adrian sobre la aplicación de la transformada de Laplace y la teoría del cable de las dendritas al análisis de la corriente eléctrica en células capaces de excitación; el primero posteriormente formó la base para las definiciones de capacitancia efectiva en una red distribuida de membranas [8] , y las discusiones sobre la teoría de cables dieron origen a nuevos métodos de "abrazadera de voltaje" aplicados a cables sin fin [9] .

Roger Tsien estuvo en estrecho contacto con químicos como Gerry Smith, Ian Baxter y Jeremy Sanders en los Laboratorios de Química de la Universidad, así como con Arye Lew y John Kimura con colegas del grupo de Denis Haydon en el Laboratorio Fisiológico. Así, aunque Tsien no era extrovertido por naturaleza, hizo muchas amistades y contactos profesionales en la universidad [7] .

Últimos años y muerte

En 2014, Tsien sufrió un derrame cerebral . Se mudó con su esposa, Wendy Globe, de San Diego a Eugene, Oregón. Dos años después, en 2016, a la edad de 64 años, Tsien murió mientras montaba en bicicleta.

El legado científico de Roger Tsien

El trabajo de Tsien se dedicó al desarrollo de varios métodos para medir iones y moléculas clave en la fisiología celular. Estos métodos, a su vez, condujeron a la creación de herramientas que permitieron realizar fenómenos importantes en fisiología y descifrar sus mecanismos ya durante la vida de un científico. También dejó atrás una cohorte de graduados e investigadores [7] .

Tsien estudió una amplia gama de pequeñas moléculas fluorescentes y proteínas fluorescentes, lo que condujo al desarrollo de métodos importantes para la visualización directa de varios procesos bioquímicos clave dentro de una célula viva e incluso de organismos vivos. Estas sustancias pueden introducirse en la célula ya sea por sus análogos penetrantes o expresándolos directamente en la célula usando técnicas de biología molecular. Algunos de ellos se pueden usar como componentes fluorescentes individuales, otros se pueden usar como pares que interactúan ( FRET ). Esto permitió que se usaran para estudiar toda una clase de procesos fisiológicos celulares, que van desde la cuestión de si los genes involucrados en este proceso están activados, pasando al estudio de la expresión, la translocación y la interacción de las proteínas participantes, y terminando con el estudio de los propios procesos fisiológicos que surgen durante la interacción de las proteínas [7 ] .

Investigación científica

Estudios de posgrado e investigación adicional en Cambridge: métodos biofísicos para monitorear la actividad fisiológica de la célula

La disertación de Tsien, completada en 1977, "El diseño y uso de instrumentos químicos en fisiología celular", recibió el prestigioso Premio Gage en Biología en Cambridge, así como una oferta de admisión al programa Comyns Berkeley Research Fellowship en Gonville and Caius College. . Durante este período, Tsien comenzó el desarrollo de indicadores químicos y luego biológicos moleculares que pueden introducirse en una célula o expresarse en ella para estudiar sus procesos fisiológicos. Esta tarea se redujo inicialmente a medir la concentración de calcio intracelular, aunque el trabajo posterior incluyó una gama mucho más amplia de iones y moléculas. El interés de Tsien por medir el calcio llegó justo en el momento adecuado: a fines de la década de 1970, la comunidad científica estaba reconociendo gradualmente el papel del calcio en el citosol como un segundo mensajero clave. La elucidación de su modificación que precede a la activación desencadenante o etapa reguladora, y el control de este proceso a través del intercambio entre compartimentos citosólicos libres y unidos, depósitos de calcio intracelular y espacio extracelular, ha sido central para comprender el mecanismo de regulación de la actividad celular.

Desarrollo de un método electroquímico para la detección y cuantificación de iones de calcio

Este problema científico surgió a partir de mediciones directas realizadas con electrodos capaces de penetrar el interior de una célula capaz de excitación; dichas medidas se utilizaron originalmente para determinar los potenciales de membrana [10] . Los electrodos selectivos para los iones de sodio, potasio, hidrógeno y cloruro ya estaban disponibles en ese momento y se usaban ampliamente [11] ; sin embargo, el uso de electrodos selectivos de calcio estaba limitado por una serie de dificultades. Los electrodos estaban sujetos al requisito de alta selectividad con respecto a los iones de calcio frente a otros cationes potencialmente presentes en el sistema, incluidos los cationes de magnesio, sodio e hidrógeno, así como al requisito de alta estabilidad del sistema con histéresis mínima cuando el calcio cambios de concentración. Tsien desarrolló más ligandos Ca 2+ -selectivos, neutros (a diferencia de los aniones utilizados - fosfatos orgánicos) como sensores [12] . Además, se requerían electrodos con un diámetro de punta suficientemente pequeño (alrededor de 0,4 micras) [13] para evitar el daño celular, lo que podría provocar un artefacto: un aumento en la concentración local de calcio. Sin embargo, las altas resistencias requeridas para ello, asociadas al electrodo, del orden de 20-30 y 60-120 GΩ en una solución con p(Ca 2+ ) = 3 y obligan a utilizar una punta con diámetros de 1,5 o 0,5 μm, a su vez, condujo a la creación de electrómetros adaptados hechos a medida con una impedancia de entrada muy alta y corrientes de polarización estables bajas (menos de 10 fA) para evitar señales falsas.

Los datos experimentales obtenidos con los electrodos optimizados satisficieron la relación de Nernst teóricamente esperada entre el voltaje de salida menos los potenciales de membrana registrados simultáneamente y la concentración de calcio libre hasta 1 µM en cloruro de potasio 0,1 M, con una respuesta que dura hasta 100 nM [Ca 2+ ] (Fig. 1). Estas mediciones fueron consistentes con los datos obtenidos por espectroscopía de luminiscencia ya establecida en fibras musculares gigantes de percebes [14] y músculos esqueléticos de rana [15] . Las mediciones en este último se realizaron utilizando el fluoróforo de aecuorina , que contiene tres motivos de mano EF de unión a Ca2 + . Aequorin se obtuvo de la medusa Aequorea victoria , que se encuentra en el Océano Pacífico frente a la costa oeste de América del Norte; la sustancia emite un destello fluorescente cuando se excita [16] [17] .

Métodos ópticos para medir Ca 2+ utilizando moléculas orgánicas desarrolladas

Así, los métodos de electrodos abrieron el camino para la determinación cuantitativa de calcio en amplios rangos de concentración, fueron selectivos con respecto al calcio en el contexto de magnesio e iones de hidrógeno, y fueron aplicables en estudios electrofisiológicos. Sin embargo, para establecer el papel fisiológico de los iones de calcio en la célula, se requería un método que también pudiera usarse en una amplia gama de condiciones experimentales y tipos de células. En este sentido, se han propuesto varios enfoques ópticos entre las técnicas de fluorescencia disponibles. Los métodos ópticos muestran una mejor estabilidad de la señal a los iones de sodio y una respuesta más rápida en comparación con los métodos de electrodos, lo que los hace adecuados para monitorear eventos celulares. A diferencia de las mediciones en un punto específico, los métodos ópticos también permitieron estimar la concentración de calcio promediada en cualquier región de interés y caracterizar la distribución espacial de los iones de calcio utilizando la microscopía confocal disponible.

La investigación de Tsien, en colaboración con Timothy Rink y Tulio Pozzan, contribuyó en gran medida al desarrollo de métodos de medición óptica y los convirtió en el enfoque principal utilizado en la actualidad en el estudio de la fisiología celular del calcio. Era necesario que los ligandos desarrollados para este fin fueran capaces de detectar cambios en las propiedades de emisión y absorción en condiciones de excitación compatibles con las condiciones de registro de señal y las condiciones de vida celular. Además, las moléculas deben ser específicas para el calcio y brindar la capacidad de medir concentraciones estacionarias e intermedias del ion. La señal luminiscente de aequorina proporcionó respuestas reproducibles a concentraciones fuera de equilibrio, sin embargo, el ligando tenía una baja afinidad por el ion, y la relación entre concentración y señal se expresó mediante una ecuación con una potencia de 2.5, lo que complicó mucho la interpretación cuantitativa del experimento. , especialmente cuando se estudian distribuciones de iones heterogéneos en el mioplasma [15] . Los fluoróforos que estuvieron disponibles más tarde proporcionaron una mayor afinidad, un rango más amplio de linealidad y una asociación más rápida con iones (antipirilazo-III, << 1 ms; diclorofosfonasa-III, <2 ms; arsenazo-III, 2-3 ms) - esto lo hizo posible realizar un seguimiento de las oleadas rápidas de calcio en el músculo esquelético [18] . Sin embargo, sustancias como el arsenazo-III y el anti-pirilazo-III mostraron una estequiometría de unión al calcio variable, formando complejos 1:2 y 2:1 dependiendo de la concentración del colorante; también sufrieron grandes cambios en sus propiedades de adsorción en respuesta a los iones de magnesio e hidrógeno en presencia de calcio [19] . Además, la presencia de concentraciones significativas del indicador podría en sí misma afectar el sistema en estudio: por ejemplo, la antipirilasa III y el arsenazo III mostraron diferentes dependencias del tiempo de absorción después de grandes pulsos de voltaje de alrededor de -20 mV. Esto da motivos para creer que uno o ambos indicadores influyeron en las transiciones de calcio [20] . La sustancia también podría unirse potencialmente a los componentes citoplásmicos o separarlos en compartimentos no citosólicos; estas son posibles interpretaciones basadas en calibraciones de cubetas in vitro . Finalmente, todos estos indicadores requerían la introducción en la celda, lo que recordaba a las mediciones de microelectrodos. Esto limitaría la aplicación del método solo a células grandes individuales suficientemente fuertes y bien adheridas, como fibras musculares, axones gigantes de calamar y células retinales de Limulus .

La capacidad de proporcionar una unión específica al calcio en el rango de concentración fisiológica de este último surgió de la idea de formar un complejo quelato con cuatro grupos carboxilo en el conocido ligando etilenglicol-bis(beta-aminoetiléter) -N,N ,N`,N`- ácido tetraacético (EGTA) (Fig. 2a), que forma un complejo estequiométrico con un ion con una composición de 1:1 [21] . Esto dio lugar al diseño racional de tampones de alta afinidad e indicadores ópticos de calcio; el primer paso en el desarrollo fue la sustitución de los grupos metileno que unen oxígeno y nitrógeno con residuos de fenilo. En uno de estos análogos, 1,2-bis(2-aminofenoxi)etano- N,N,N ` ,N `-ácido tetraacético (BAPTA), dos anillos de benceno reemplazan los grupos metileno que conectan los átomos de N y O con preservación de la geometría general, la especificidad y la afinidad de la molécula por el calcio (Fig. 2b). BAPTA es un tampón de calcio intracelular ampliamente utilizado y eficaz, cuya unión, en comparación con EGTA, se ve menos afectada por la acidez del medio, es más selectiva con respecto al calcio en un medio de magnesio y tiene una mayor tasa de formación y destrucción de el complejo.

Sin embargo, EGTA absorbe luz en la región ultravioleta lejana y no emite fluorescencia. BAPTA se caracteriza por un espectro de fluorescencia UV que cambia con la unión del calcio, alcanzando un máximo de alrededor de 250 nm, lo que no es bueno para el análisis fluorescente. Se encontró que el reemplazo de un oxobenceno con un anillo de metoxiquinolina condujo a la aparición de máximos de absorción y emisión a 340 y 492 nm, respectivamente, en el nuevo compuesto quin-2 (Fig. 2c). Estas longitudes de onda no cambiaron, sin embargo, la intensidad de la fluorescencia aumentó en un factor de seis cuando se unió el calcio. Las mediciones se calibraron a concentraciones típicas de calcio citosólico en reposo (10 −7 M) e inferiores, hasta 10 −8 M. Otros métodos disponibles en ese momento tenían una detección óptima solo en concentraciones en estado activado (10 −6 M), entonces, ¿cómo las señales en reposo ya estaban por debajo del límite de detección.

Finalmente, la incubación de células en soluciones que contenían un resto de acetometoxiéter (AM) permeable a la membrana unido a quin-2 (quin-2-AM) resultó en una entrada atraumática y permanente de la sustancia en la célula sin micromanipulación o interrupción de la membrana. Una vez que la molécula entró en la célula, las esterasas endógenas cortaron el componente éster y liberaron el tetraanión activo (7) que no atravesó la membrana (Fig. 2d). El aumento de la intensidad de la fluorescencia con el aumento de la concentración de calcio podría controlarse utilizando un espectrofotómetro de cubeta convencional. Por lo tanto, la quin-2 ha adquirido un papel clave en la medición del calcio citosólico en una amplia gama de células de mamíferos y sus suspensiones, incluidos linfocitos, plaquetas, espermatozoides, neutrófilos y macrófagos, especialmente cuando se estudia el papel del calcio en el proceso de señal-respuesta. [22] [23 ] . En el futuro, este método de introducir derivados permeables a la membrana esterificados en la célula se amplió para estudiar las funciones de moléculas candidatas para el papel de mensajeros celulares, como el fosfatidilinositol-3,4,5-trifosfato, en la fisiología celular [24]. ] .

UC Berkeley: Nuevos ligandos para medir y manipular el calcio intracelular y otros iones

Posiblemente debido a las dificultades para encontrar empleo y las perspectivas laborales poco claras que surgieron para los científicos dedicados a la investigación interdisciplinaria en el Reino Unido, en 1981 Tsien, después de una investigación tan importante, aceptó una invitación para conseguir un trabajo en el Departamento de Fisiología y Anatomía de la Universidad . de California en Berkeley (en ese momento el departamento estaba dirigido por Terry Manchen) a razón de profesor asistente. Tsien trabajó allí durante ocho años, una de las áreas de trabajo fue el desarrollo y la optimización de ligandos sensibles al calcio en colaboración con Steven Adam y Robert Zucker. Gracias a este proyecto, se introdujeron en la producción comercial muchos reactivos que están muy extendidos en la fisiología celular. Todos ellos entraron en las células tras la incubación del sistema estudiado con los correspondientes derivados de AM. Las sustancias que combinan un resto quelante de tetracarboxilato de 8 coordenadas con un cromóforo de estilbeno dieron una selectividad de calcio mejorada sobre otros cationes doblemente cargados y una afinidad solo ligeramente menor que la quin-2 [21] . Las afinidades de estas sustancias oscilaron entre K d = 100 nM (quin-2) y K d = 90 μM (fluoro-5N), lo que cubría las concentraciones fisiológicas típicas de calcio en una amplia gama de tipos de células excitadas y en reposo. Las longitudes de onda de excitación más altas en comparación con la quin-2 (339 nm) permitieron evitar la irradiación ultravioleta de las células, lo que podría conducir a la autofluorescencia de la célula excitada y causar su daño. La introducción del grupo etileno del estilbeno en el anillo heterocíclico mejoró el rendimiento cuántico y la estabilidad fotoquímica: la intensidad de la fluorescencia podría aumentar hasta 30 veces. Esta mejora en el coeficiente de extinción y el rendimiento cuántico en comparación con quin-2 (<5000 y 0,03 en comparación con 0,14, respectivamente) también redujo la cantidad de etiquetado requerido en el sistema (por lo tanto, en el caso de quin-2 estamos hablando de milimolar concentraciones). El hecho es que grandes cantidades podrían potencialmente formar un sistema amortiguador con calcio intracelular e interrumpir el proceso en estudio.

Finalmente, además de cambiar la intensidad de la fluorescencia de las sustancias, las longitudes de onda de la unión del calcio también cambiaron, mientras que la quin-2 produjo cambios solo en la intensidad de la señal (esto hizo que la medición fuera sensible a las variaciones en la intensidad de la irradiación, la detección de la señal, la concentración del ligando, y espesor de celda efectivo en el haz óptico). Las mediciones que utilizan cambios espectrales en la región de absorción y/o emisión hicieron posible eludir estas fuentes de artefactos [25] . Por lo tanto, indo-1 tuvo un pico de emisión doble con un cambio principal de 475 a 400 nm tras la unión del calcio. Indo-1 ha encontrado una amplia aplicación en citometría de flujo (Fig. 3a). Fura-2 solo emite a una longitud de onda de 510 nm, pero el pico de excitación cambia de aproximadamente 380 a 350 nm al unirse, y la relación de intensidad está directamente relacionada con la concentración de iones. El alto rendimiento de fotones de este compuesto lo hizo conveniente incluso con la grabación de video en tiempo real de la concentración local de calcio intracelular [26] (Fig. 3b).

Estos logros dieron lugar a la creación de una amplia clase de nuevas moléculas detectoras de varios iones y moléculas involucradas en procesos fisiológicos [27] . Primero, estas nuevas variantes permitieron medir la concentración de calcio en diferentes condiciones y tipos de células. La señal de fluo-3 se registra en la región visible al excitarse con un láser de argón a 488 nm, aumentando al unirse a un máximo de emisión a 525 nm, que se acerca a los valores detectados en las mediciones con isotiocianato de fluoresceína (FITC) ( Figura 3c). Su disociación más rápida en comparación con fura-2 permite rastrear la cinética rápida del calcio en los músculos esqueléticos y cardíacos. Esto ha sido particularmente útil en el registro de eventos microscópicos de liberación de calcio ("destellos de calcio") utilizando microscopía confocal.28 La función también se ha utilizado para registrar las ondas de propagación de Ca 2+ encubiertas resultantes , lo que refleja una mayor liberación de calcio de los receptores de rianodina en el retículo sarcoplásmico . , que surge debido a la falta de conjugación de los canales con un receptor de dihidropiridina transmembrana en circunstancias esqueléticas [29] o proarrítmicas en los músculos cardíacos [30] [31] .

En segundo lugar, se hizo posible detectar y medir la concentración no solo del calcio intracelular, sino también de otros participantes en los procesos. Por ejemplo, los grupos carboxilo del derivado de carboxifluoresceína 2',7'-bis-(2-carboxietil)-5-(u-6)-carboxifluoresceína (BCECF) fueron más adecuados para determinar los iones de hidrógeno que el calcio. La accesibilidad de BCECF se logró mediante un análogo de AM que penetraba en las células, y la sustancia en sí tenía un pico de emisión único (535 nm) y un pico de excitación doble (alrededor de 490 y 440 nm). Su pKa ( alrededor de 6,98) y su respuesta lineal entre pH 6,4 y 7,4 aseguraron su aplicabilidad en fisiología celular en células parietales gástricas [32] .

En tercer lugar, la luz podía liberar calcio de forma reversible de Nitr-2 y más tarde desarrolló Nitr-5 y DM-nitrofen [33] . Nitr-2 consiste en un BAPTA quelante de calcio acoplado a un grupo nitropiperonilo que es capaz de someterse a fotólisis por luz ultravioleta cercana (300–400 nm). Este evento cambia significativamente la constante de disociación del calcio de 160 y 630 nM a 7 y 18 µM a una fuerza iónica de 0,1 y 0,3 M, respectivamente, liberando calcio unido y cambiando así la concentración de calcio intracelular [34] (Fig. 4a-c ). La propiedad ha encontrado aplicación en el control fotoquímico de las corrientes de iones en las neuronas [35] . Luego, Tsien desarrolló este enfoque para otros controladores bioactivos, y la resolución espacial se logró enfocando la fuente de excitación del láser en tres coordenadas. Como resultado, el acoplamiento de 7-hidroxicumarina-4-ilmetilos bromados con mediadores candidatos mejoró el rendimiento de la liberación usando excitación infrarroja (a diferencia de UV) de dos fotones e hizo posible por primera vez obtener un mapa tridimensional. de la sensibilidad al glutamato en secciones de neuronas cerebrales corticales de rata [36] .

Desarrollo de marcadores de proteínas fluorescentes

Incluso antes de que Tsien se mudara a San Diego en 1989, el trabajo de Alexander Glaser sobre las ficobiliproteínas fluorescentes despertó su interés en el rastreo de AMPc fluorescente. Consideró las proteínas de unión a AMPc naturales como la base para un marcador fluorescente: esto podría proporcionar inmediatamente las afinidades y selectividades requeridas. En ausencia de AMPc, la fosfocinasa A (PKA) está inactiva y sus subunidades reguladora y catalítica están estrechamente acopladas (fig. 5). La unión de cAMP a subunidades reguladoras conduce a la disociación y activación catalítica, lo que permite la transferencia de fosfato desde ATP a ciertas proteínas específicas. Dando a la enzima una señal óptica para tales eventos de unión, Roger volvió a sus intereses universitarios en la transferencia de energía de resonancia fluorescente (FRET) entre dos cromóforos sensibles a la luz que están estéricamente cerca uno del otro. Un cromóforo donante excitado puede transferir energía a un aceptor debido a la interacción dipolo-dipolo no radiativa. Este sistema se construyó uniendo un fluoróforo tipo 1 a la subunidad reguladora y un fluoróforo tipo 2 a la subunidad catalítica. FRET podría surgir en PKA intacta con contacto cercano de subunidades de los dos tipos, pero debería haber desaparecido tras la disociación después de la unión de cAMP: entonces las señales en estas dos situaciones se observarían en diferentes longitudes de onda. Estos experimentos, realizados con el grupo de Suzanne Taylor, se caracterizaron por un arduo trabajo que requería una gran constancia: se necesitaban grandes cantidades de subunidades de PKA recombinantes. A pesar de las dificultades, el proyecto tuvo éxito y dio lugar a un método en el que las subunidades catalíticas marcadas con fluoresceína se unen a las subunidades reguladoras marcadas con rodamina para formar sensores cAMP FRET [37] . Este método ha encontrado aplicación en el estudio de osteoblastos [38] , melanocitos [39] y neuronas Aplysia [40] .

En la Universidad de California en San Diego: desarrollo de indicadores macromoleculares codificados genéticamente

El uso de proteínas fluorescentes complementó elegantemente la clase de ligandos de bajo peso molecular. Sin embargo, las proteínas necesarias tenían que expresarse y purificarse en grandes cantidades para unir selectivamente dos etiquetas diferentes in vitro a diferentes dominios o subunidades de proteínas manteniendo las funciones de las proteínas. Además, en trabajos anteriores, también había que introducir proteínas en la célula. Estas dificultades obligaron a los investigadores a desarrollar indicadores codificados directamente en el genoma; en este caso, solo fue necesario introducir genes que codifican dos proteínas fluorescentes del color correcto en las células en estudio. Este enfoque tenía requisitos mucho más bajos e implicaba el uso de procedimientos establecidos para la transfección de células con una pequeña cantidad de ADN (en comparación con la introducción de proteína) con la posterior selección selectiva de células transfectadas. Esta tarea llamó la atención de Tsien sobre la medusa Aequorea victoria (por segunda vez) , una fuente de aequorina [16] tan útil en los experimentos fisiológicos clásicos. Shimomura descubrió, aisló y purificó la proteína fluorescente verde (GFP) de aproximadamente 10 000 individuos, seguido de la caracterización de sus propiedades fisicoquímicas, incluidas las espectrales, en diversas condiciones. Demostró que GFP es un aceptor de excitación FRET del donante de aecuorina y produce fluorescencia in vivo en la región verde del espectro, diferente de la señal azul de la preparación de aecuorina purificada tras la excitación en la región UV [41] . Shimomura también identificó un resto cromóforo p -hidroxibencilidenimidazolina en la cadena proteica [42] .

La caracterización de una parte del gen GFP por Douglas Prasher [43] inició un trabajo colaborativo en diferentes laboratorios. Roger ha trabajado en las propiedades de producción y fluorescencia de GFP usando Saccharomyces cerevisiae en colaboración con Roger Heim y Scott Emre. Martin Chalfie (Miembro extranjero de la Royal Society of London, 2018) del estado de Columbia, quien demostró por primera vez la fluorescencia inducida por UV de GFP inyectada en células de invertebrados y propuso el uso potencial de la proteína como biomarcador, ha estado trabajando en su expresión en Escherichia coli y Caenorhabditis elegan. La investigación de Tsien resultó en el descubrimiento de un mutante Y66H (BFP) con una fluorescencia azul estable mejorada en relación con la GFP de tipo salvaje original. Otras modificaciones de la proteína, que acomodan estereoquímicamente al triptófano, llevaron a la aparición del mutante Y66W que codifica la proteína fluorescente cian (CFP) [44] [45] (Fig. 6a). En el par FRET, los cambios conformacionales en la estructura de BFP excitado por UV condujeron a la transferencia de energía a GFP (Fig. 6b). Esto implicaba la capacidad de GFP para ser excitado por las longitudes de onda azules emitidas por el donante de BFP. Sin embargo, el espectro de excitación de GFP tenía un gran pico en la UV y un pequeño pico en la región azul. El problema se resolvió creando una variante GFP mutante: el pico no deseado en la región UV desapareció y el azul aumentó aproximadamente 5-6 veces con un cambio posterior de +10 nm después de la mutación S65T [45] . En un intento por probar la hipótesis, los investigadores introdujeron un enlace peptídico entre BFP y el mutante GFP-S65T, así como otros mutantes que tienen un perfil de excitación similar al de GFP-S65T. De hecho, la excitación UV selectiva de BFP dio como resultado diferentes tipos de emisión verde y azul en presencia o ausencia de transferencia FRET antes y después de la tripsinólisis de proteínas. Pruebas adicionales confirmaron que S65T es el fluoróforo óptimo cuando se introduce la mutación F64L, que proporciona retención de estructura y plegamiento a temperaturas más altas [46] . Este doble mutante, denominado "GFP (S65T-F64L) mejorado", está disponible comercialmente en Clontech.

Los estudios estructurales de GFP-S65T revelaron una estructura cilíndrica con un diámetro de 2,4 nm y una longitud de 4,0 nm, que incluía 11 hebras β que rodeaban una hélice alargada axialmente, en el centro de la cual se insertó un cromóforo [47] (Fig. 7 ). Por lo tanto, la agrupación estaba protegida de los efectos del solvente y las enzimas extrañas, pero dentro de la cavidad había espacio para la posible introducción de un anillo aromático, que se asociaría mediante apilamiento con el cromóforo; esto se verificó más tarde mediante la introducción de una serie de mutaciones, incluida la T203Y, el espectro de esta variante tenía cambios de excitación y emisión de aproximadamente 20 nm. La proteína fluorescente amarilla resultante (YFP) y sus variantes mutantes adicionales demostraron ser buenos aceptores de señales de CFP, formando pares CFP/YFP alternativos.

Roger también confirmó la formación de un resto cromóforo p -hidroxibencilidenimidazolina a partir de los residuos S65, Y66 y G67 en la cadena GFP [31] . El mecanismo de aparición del cromóforo implicó una sorprendente formación de novo de un heterociclo con deshidrogenación del enlace α-β C-C para formar un doble enlace. Para esto, se necesitaba un aceptor de hidrógeno: Tsien creía que era oxígeno atmosférico. El cultivo de bacterias productoras de GFP en condiciones anaeróbicas condujo a que la proteína sintetizada no tuviera fluorescencia, pero se manifestó varias horas después de la exposición de la proteína al aire [44]  , propiedad que luego encontró su aplicación en el estudio de fisiología.

Creación de proteínas detectoras mediante el emparejamiento "donante FRET" - "proteína GFP aceptora"

El uso de imágenes FRET de señales intracelulares específicas requería el acoplamiento de componentes FRET a una molécula que se uniría específicamente al componente celular en estudio. En colaboración con Atsushi Miyawaki, Roger intentó unir las proteínas donadora y aceptora a los extremos opuestos del dominio citosólico del receptor de inositol-1,4,5-trifosfato (InsP3) recién clonado. Lo más probable es que este trabajo fuera un reflejo de su interés en la señalización química entre las membranas celulares. El proyecto condujo a la comprensión de cómo funciona este importante mensajero en el músculo esquelético en la unión de excitación-contracción [48] y cómo funciona el factor de entrada de Ca 2+ [49] , proporcionando transducción desde los depósitos intracelulares de Ca 2+ a la superficie de la membrana de compuerta de Ca2 + operada en depósito [50] . En el caso de la señalización, se demostró posteriormente que el proceso procede bajo la influencia del acoplamiento directo, en lugar de químico, entre los canales de calcio de tipo L de superficie y los receptores de liberación de calcio de rianodina reticular sarcoplásmica intracelular [51] . Sin embargo, las dificultades derivadas de la comprensión incompleta del mecanismo de unión de InsP3 a los receptores obligaron a Tsien a centrar su atención en el desarrollo de otros detectores de calcio intracelular junto con Mitsushiko Ikura. Este trabajo implicó unir BFP y luego CFP al extremo N de la calmodulina (CaM). S65T y luego YFP, por el contrario, se unieron al extremo C-terminal del péptido M13 diana. La estructura final se obtuvo combinando fragmentos CaM y M13 [52] [53] .

Las etiquetas codificadas genéticamente ("camaleones") obtenidas de esta manera, capaces de usarse a largo plazo y aplicables a cualquier célula u organismo en el que se pueda introducir dicho ADN, llevaron a la aparición de uno de los métodos más populares para rastrear la actividad en identificados. neuronas y amplió la gama de objetos estudiados a sistemas nerviosos intactos. Además, han ampliado los límites de las moléculas biológicamente importantes utilizadas. Los esfuerzos significativos de los investigadores han llevado al descubrimiento de enlazadores que aseguran la fusión de proteínas fluorescentes con PCA mientras mantienen la capacidad de las subunidades para responder a la presencia de AMPc. Tales proteínas podrían visualizar la distribución subcelular de AMPc en los cardiomiocitos después de la estimulación con catecolaminas [54] . Finalmente, un camaleón modificado en el que M13 fue reemplazado por un péptido sustrato de cinasa y CaM por un dominio de proteína que contiene un dominio de unión a fosfoaminoácidos que puede unirse a serina, treonina o tirosina fosforiladas fue capaz de visualizar la actividad de las cinasas que fosforilan específicamente la serina, treonina o tirosina, respectivamente. La fosforilación de estos residuos por la cinasa conduce a la formación de un complejo en el que se cambia la distancia o la orientación entre las proteínas donadoras y aceptoras [55] . Pronto este método se volvió indispensable en la práctica de la investigación.

Finalización de la paleta de colores de proteínas fluorescentes; ampliando el alcance de FRET para medir el potencial de membrana

Otros desarrollos se han sumado al arsenal de proteínas fluorescentes, cubriendo una amplia gama del espectro y permitiendo la fotoconmutación [56] [57] [58] . El descubrimiento y la disponibilidad del gen que codifica la proteína fluorescente roja coralina (DsRed) [59] llevó a Roger a ir más allá de la GFP en su investigación. DsRed es un tetrámero cuyo resto cromóforo comienza de la misma manera que en GFP. Sin embargo, una mayor deshidrogenación conduce a la formación de acilimina, que es estable solo en el entorno de la proteína intacta y muestra un cambio de longitud de onda larga en los espectros de absorción y emisión [60] [61] . Por evolución dirigida, se creó una proteína monomérica roja fluorescente (RFP), que es menos exigente para la fusión con otras proteínas en comparación con el tetrámero y se convirtió en la base de todo un conjunto de proteínas monoméricas, cuyos máximos de emisión cubrían el resto del espectro visible. hasta 648 nm [62] .

Roger también participó en la manipulación de la propia técnica FRET, siguiendo sus primeros intereses de investigación en las mediciones ópticas del potencial de membrana. Esto ha sido capaz de mejorar los métodos bien establecidos pero a menudo relativamente lentos o insensibles basados ​​en un solo fluoróforo indicador. Un enfoque basado en FRET de dos componentes utilizó lectinas fluorescentes como donante y, más tarde, fosfatidiletanolamina marcada con cumarina unida al lado exterior de la membrana (Fig. 8). Los donantes transfirieron energía a un aceptor de tri (o penta) metinoxonol de bis (1,3-dihexil-2-tiobarbitúrico) transmembrana cargado cuando pasó del lado externo de la membrana al lado interno debido a la carga cuando cambió el potencial de la membrana. Este enfoque hizo posible lograr una sensibilidad sin precedentes (por cada 100 mV, la señal de fluorescencia aumentaba más del 50 %) y constantes de tiempo cortas (menos de 0,4 ms) en comparación con otros indicadores ópticos [63] .

De la fisiología celular a la fisiología de sistemas, la medicina traslacional y la difusión de nuevos indicadores

Hacia el final de su carrera científica, Tsien pudo desarrollar tales herramientas de análisis óptico que se utilizaron con particular éxito en el estudio de órganos completos o incluso animales. Estas herramientas podrían utilizarse potencialmente en los campos de la medicina clínica, neuroquirúrgica, cardiovascular u oncológica. Algunos de ellos fueron desarrollados en colaboración con Nguyen Thao Quyen ( vietnamita: Quyến Thẩm Nguyễn ) . Una nueva molécula F-NP41 marcada con fluorescencia, que se introduce fácilmente en la célula y se une al nervio, y tiene como objetivo interactuar con la proteína de la membrana basal laminina, puede mejorar la visualización operativa de los nervios crónicamente truncados [64] [65] , simplificando potencialmente el diseño y la implementación quirúrgica de los nervios de “reparación” [66] [67] . Una técnica de marcaje de tomografía por emisión de positrones que utiliza eritrocitos inyectados marcados con un marcador fluorescente multimodal emisor de positrones podría usarse potencialmente para detectar hemorragia intracraneal como una alternativa a las sustancias marcadas con 99mTc [68] y podría ser útil en estudios experimentales de RMN de procesos fisiopatológicos cerebrales [ 69] . La introducción de péptidos que penetran la membrana que muestran cambios significativos en la fluorescencia después de ser cortados por proteasas asociadas a tumores dentro de la célula podría ayudar potencialmente en el diagnóstico temprano de lesiones malignas [70] . Se ha encontrado que tanto estos péptidos activadores como sus formas dendrímeras unidas al gadolinio se acumulan selectivamente en las células tumorales, lo que mejora la detección de estas últimas y ofrece un medio para su futuro diagnóstico por RMN [71] . Los péptidos activadores se han utilizado de manera similar para administrar selectivamente el radiosensibilizador antitubulina monometilauristatina E a las células tumorales, abriendo un nuevo horizonte terapéutico para estos agentes [72] .

A lo largo de su carrera, Tsien ha tratado de poner a disposición de sus colegas los ligandos que desarrolló. En el desarrollo temprano de quin-2, Roger no logró convencer a la Corporación Nacional de Investigación y Desarrollo del Reino Unido del valor comercial de una estructura generalizada sensible al calcio con una precisión y selectividad sin precedentes. Más tarde, Lancaster Synthesis (ahora parte de Johnson Matthey Company Alfa Aesar) expresó interés en quin-2 y su derivado AM. Uno de los resultados de la actividad científica de Roger son unas 160 patentes estadounidenses. Tsien también fundó varias empresas: con Charles Zucker, creó Aurora Biosciences Corporation, que produce herramientas para el descubrimiento de fármacos utilizando marcadores fluorescentes, y Senomyx, que se dedica a la búsqueda de moduladores de papilas gustativas. Gracias a sus patentes, otras personas también han podido formar empresas, como Molecular Probes.

Honores y premios

Premio Nobel

Roger compartió el Premio Nobel de Química 2008 con Osamu Shimomura ( Woods Hole Marine Biological Laboratory ) y Martin Chalfie ( Universidad de Columbia , EE. UU.). La redacción del comité enfatizó específicamente la contribución de Tsien para comprender las propiedades fluorescentes de GFP y proteínas relacionadas, lo que condujo a su aplicación en el estudio de procesos dinámicos en sistemas vivos. En honor y respeto por Douglas Prasher, quien primero comenzó la tarea de estudiar GFP, invitó a Tsien a la ceremonia.

Otros premios

Membresía en organizaciones y sociedades

Familia

Tsien estaba casado con Wendy Globe. Roger no tuvo hijos propios; crió a su hijastro Max Rink con su esposa.

Cualidades personales

Según su amigo Christopher Huang, Tsien y su supervisor de posgrado Richard Adrian "compartían valores, comportamientos científicos y personales similares, una actitud amable, generosa y respetuosa hacia el mundo y una actitud eminentemente honesta y humana hacia los demás".

Intereses y aficiones

Se dedica a la fotografía amateur. Le encantaban las actividades al aire libre.

Véase también

Notas

  1. ↑ 1 2 3 4 https://www.washingtonpost.com/national/health-science/roger-y-tsien-chemist-shared-nobel-for-tool-to-research-alzheimers-dies-at-64/2016 /08/31/90ca6de8-6fc9-11e6-8533-6b0b0ded0253_story.html
  2. ↑ 1 2 Roger Y. Tsien // Enciclopedia  Británica
  3. ↑ 1 2 Roger Y. Tsien // Enciclopedia Brockhaus  (alemán) / Hrsg.: Bibliographisches Institut & FA Brockhaus , Wissen Media Verlag
  4. ↑ 钱永健研水母发光盼助治癌(enlace no disponible) . Lianhe Zaobao . Consultado el 8 de octubre de 2008. Archivado desde el original el 25 de diciembre de 2018. 
  5. ↑ Roger Y. Tsien en la Universidad de California, San Diego  (enlace no disponible)  (enlace no disponible)
  6. ↑ Sitio web del comité del Premio Nobel . Consultado el 8 de octubre de 2008. Archivado desde el original el 26 de octubre de 2012.
  7. ↑ 1 2 3 4 5 Huang CL-H. Roger Yonchien Tsien. 1 de febrero de 1952 - 24 de agosto de 2016 // Biogr. Mems cayó. R. Soc., 2018, v. 65, pág. 405-428.
  8. ↑ Adrian RH, Almers W. Medición de la capacidad de la membrana en el músculo esquelético.// Nat. New Biol., 1973, v. 242, pág. 62-64.
  9. ↑ Adrian, RH, Marshall, MW Corrientes de sodio en el músculo de los mamíferos // J. Physiol., 1977, v. 268, pág. 223-250.
  10. ↑ Adrian RH El efecto de la concentración de potasio interna y externa sobre el potencial de membrana del músculo de rana. // J. Physiol., 1956, v. 133, pág. 631-658.
  11. ↑ Thomas R. Microelectrodos intracelulares sensibles a iones. Nueva York, NY: Prensa Académica, 1978.
  12. ↑ Tsien RY, Rink TJ Microelectrodos selectivos de iones portadores neutros para medir el calcio libre intracelular. // Bioquímica. Biografía. Acta Biomembr., 1980, v. 599, pág. 623-638.
  13. ↑ Tsien RY Sensores líquidos para microelectrodos selectivos de iones. // Trends Neurosci., 1980, v. 3, pág. 219-221.
  14. ↑ Tsien RY, Ashley C., Rink TJ Cambios en el Ca libre durante la contracción muscular, medidos con un electrodo selectivo de Ca intracelular // J. Physiol., 1978, v. 280, pág. 27
  15. ↑ 1 2 Blinks JR, Rüdel R., Taylor SR Transitorios de calcio en fibras musculares esqueléticas anfibias aisladas: detección con aequorina // J. Physiol., 1978, v. 277, pág. 291-323.
  16. ↑ 1 2 Shimomura O., Johnson F., Saiga Y. Extracción, purificación y propiedades de la aecuorina, una proteína bioluminiscente del hidromedusano luminoso, Aequorea // J. Cell Comp. Fisiol., 1962v. 59, pág. 223-239.
  17. ↑ Shimomura O. La luminiscencia de la aecuorina se desencadena por la unión de dos iones de calcio // Biochem. Biografía. Res. Comun., 1995, v. 211, pág. 359-363.
  18. ↑ Csernoch L., Huang CL-H., Szucs G., Kovacs L. Efectos diferenciales de la tetracaína en los movimientos de carga y las señales de Ca2+ en el músculo esquelético de la rana // J. Gen. Physiol., 1988, v. 92, pág. 601-612.
  19. ↑ Baylor SM Estudios ópticos del acoplamiento de excitación-contracción usando sondas sensibles al voltaje y al calcio // Comp. Physiol., 2011 (publicación original: Handb. Physiol., Skelet. Muscle Suppl., 1983, v. 27, pp. 355-379).
  20. ↑ Palade P., Vergara J. Arsenazo-III y antipyrylazo-III transitorios de calcio en fibras musculares esqueléticas individuales // J. Gen. Physiol., 1982, v. 79, pág. 679-707.
  21. ↑ 1 2 Tsien RY Nuevos indicadores de calcio y tampones con alta selectividad contra magnesio y protones: diseño, síntesis y propiedades de estructuras prototipo // Bioquímica, 1980, v. 19, pág. 2396-2404.
  22. ↑ Tsien RY, Pozzan T., Rink TJ Los mitógenos de células T provocan cambios tempranos en el Ca2+ libre citoplasmático y el potencial de membrana en los linfocitos. Naturaleza, 1982, v. 295, pág. 68-71.
  23. ↑ Tsien RY, Pozzan T., Rink TJ Homeostasis del calcio en linfocitos intactos: calcio libre citoplasmático monitoreado con un indicador fluorescente atrapado intracelularmente // J. Cell Biol., 1982, v. 94, pág. 325-334.
  24. ↑ Tsien RY, Jiang T., Sweeney G., Rudolf MT , Klip A., Traynor-Kaplan A. Ésteres permeables a la membrana de fosfatidilinositol 3,4,5-trifosfato // J. Biol. Chem., 1998, v. 273, pág. 11 017-11 024.
  25. ↑ Tsien RY, Grynkiewicz G., Poenie M. Una nueva generación de indicadores de Ca2+ con propiedades de fluorescencia muy mejoradas // J. Biol. Chem., 1985, v. 260, pág. 3440-3450.
  26. ↑ Cannell MB, Berlin JR, Lederer WJ Calcio intracelular en miocitos cardíacos: transitorios de calcio medidos mediante imágenes de fluorescencia // Soc. general fisiol. Ser., 1987, v. 42, pág. 201-214.
  27. ↑ Haugland R. El manual de sondas moleculares: una guía para sondas fluorescentes y tecnologías de etiquetado // . ThermoFisher Scientific, Waltham, MA EE. UU., 2010 págs. 99-121. Modo de acceso: https://www. thermofisher.com/uk/en/home/references/molecular-probes-the-handbook.html. Consultado el 6 de junio de 2018.
  28. ↑ Cheng H., Lederer MR, Xiao RP, Gómez AM, Zhou YY, Ziman B., Spurgeon H., Lakatta EG, Lederer WJ Acoplamiento de excitación-contracción en el corazón: nuevos conocimientos de las chispas de Ca2+ // Cell Calcium, 1996, v . 20, pág. 129-140.
  29. ↑ Chawla S., Skepper JN, Hockaday AR, Huang, CL-H. Ondas de calcio inducidas por soluciones hipertónicas en fibras musculares esqueléticas de rana intactas // J. Physiol., 2001, v. 536, pág. 351-359.
  30. ↑ Goddard CA, Ghais NS, Zhang Y., Williams AJ, Colledge WH, Grace AA, Huang CL-H. Consecuencias fisiológicas de la mutación P2328S en el gen del receptor de rianodina (RyR2) en corazones murinos genéticamente modificados // Acta Physiol., 2008, v. 194, pág. 123-140.
  31. ↑ 1 2 Cody CW, Prasher DC, Westler WM, Prendergast FG, Ward WW Estructura química del cromóforo hexapéptido de la proteína fluorescente verde Aequorea // Bioquímica, 1993, v. 32, pág. 1212-1218.
  32. ↑ Tsien RY, Paradiso AM, Machen TE Intercambio de Na±H+ en las glándulas gástricas medido con un indicador de pH fluorescente atrapado en el citoplasma // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 1984, v. 81, pág. 7436-7440.
  33. ↑ Zucker RS ​​​​Efectos de quelantes de calcio fotolábiles en indicadores de calcio fluorescentes // Cell Calcium, 1992, v. 13, pág. 29-40.
  34. ↑ Tsien RY, Zucker RS ​​​​Control del calcio citoplasmático con quelantes de 2-nitrobenzhidrol de tetracarboxilato fotolábil // Biophys. J., 1986, v. 50, pág. 843-853.
  35. ↑ Gurney AM, Tsien RY, Lester HA Activación de una corriente de potasio mediante aumentos graduales rápidos de calcio intracelular generados fotoquímicamente en neuronas simpáticas de ratas // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 1987, v. 84, pág. 3496-3500.
  36. ↑ Tsien RY, Furuta T., Wang SS-H., Dantzker JL, Dore TM, Bybee WJ, Callaway EM, Denk W. 7-hidroxicumarina-4-ilmetilos bromados: grupos protectores fotolábiles con secciones transversales biológicamente útiles para dos fotólisis de fotones // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 1999, v. 96, pág. 1193-1200.
  37. ↑ Tsien RY, Adams SR, Harootunian AT, Buechler YJ, Taylor SS Imágenes de relación de fluorescencia de AMP cíclico en células individuales // Nature, 1991, v. 349, pág. 694-697.
  38. ↑ Tsien RY, Civitelli R. , Bacskai BJ, Mahaut-Smith MP, Adams SR, Avioli LV Análisis de una sola célula de la respuesta del AMP cíclico a la hormona paratiroidea en células osteoblásticas // J. Bone Min. Res., 1994, v. 9, pág. 1407-1417.
  39. ↑ Tsien RY, Sammak PJ, Adams SR, Harootunian AT, Schliwa M. El AMP cíclico intracelular, no el calcio, determina la dirección del movimiento de las vesículas en los melanóforos: medición directa mediante imágenes de proporción de fluorescencia // J. Cell Biol., 1992, v. 117, pág. 57-72.
  40. ↑ Tsien RY, Bacskai BJ, Hochner B., Mahaut-Smith M., Adams SR, Kaang BK, Kandel ER Dinámica resuelta espacialmente de las subunidades de AMPc y proteína quinasa A en las neuronas sensoriales de Aplysia // Science, 1993, v. 260, pág. 222-226.
  41. ↑ Morise H., Shimomura O., Johnson FH, Winant J. Transferencia de energía intermolecular en el sistema bioluminiscente de Aequorea // Bioquímica, 1974, v. 13, pág. 2656-2662.
  42. ↑ Shimomura O. Estructura del cromóforo de la proteína verde fluorescente de Aequorea // FEBS Lett., 1979, v. 104, pág. 220-222.
  43. ↑ Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ Estructura primaria de la proteína fluorescente verde Aequorea victoria // Gene, 1992, v. 111, pág. 229-233.
  44. ↑ 1 2 Heim TR, Prasher DC, Tsien RY Mutaciones de longitud de onda y autooxidación postraduccional de la proteína verde fluorescente. proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 1994, v. 91, pág. 12501-12504.
  45. ↑ 1 2 Tsien RY, Heim R. Ingeniería de proteína verde fluorescente para mejorar el brillo, longitudes de onda más largas y transferencia de energía de resonancia de fluorescencia // Curr. Biol., 1996, v. 6, pág. 178-182.
  46. ↑ Cormack BP, Valdivia RH, Falkow, S. Mutantes optimizados por FACS de la proteína verde fluorescente (GFP) // Gene, 1996, v. 173, pág. 33-38.
  47. ↑ Tsien RY, Brejc K., Sixma TK, Kitts PA, Kain S.R. , Ormo M., Remington SJ Base estructural para la excitación dual y la fotoisomerización de la proteína fluorescente verde Aequorea victoria. proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos, 1997, v. 94, pág. 2306-2311.
  48. ↑ Tsien RY, Vergara J., Delay M. Inositol 1,4,5-trifosfato: un posible vínculo químico en el acoplamiento de excitación y contracción en el músculo // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 1985, v. 82, pág. 6352-6356.
  49. ↑ Randriamampita C., Tsien RY La degradación de un factor de entrada de calcio (CIF) puede bloquearse mediante inhibidores de fosfatasa o quelación de Ca2+ // J. Biol. Chem., 1995, v. 270, pág. 29-32.
  50. ^ Putney JW Formas y funciones de los mediadores de entrada de calcio operados por almacenamiento STIM y Orai // Adv. Biol. Reg., 2017, v. 68, pág. 88-96.
  51. ↑ Huang CL-H., Pedersen TH, Fraser JA Interacciones recíprocas de los receptores de dihidropiridina y rianodina en la activación del músculo esquelético // J. Muscle Res. Cell Motil., 2011, v. 32, pág. 171-202.
  52. ↑ Tsien RY, Miyawaki A., Llopis J., Heim R., Michael McCaffery J., Adams JA, Ikura M. Indicadores fluorescentes para Ca2+ basados ​​en proteínas fluorescentes verdes y calmodulina // Nature, 1997, v. 388, pág. 882-887.
  53. ↑ Tsien RY, Miyawaki A., Griesbeck O., Heim R. Mediciones dinámicas y cuantitativas de Ca2+ usando camaleones mejorados // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 1999, v. 96, pág. 2135-2140.
  54. ↑ Zaccolo M., Pozzan T. Microdominios discretos con alta concentración de AMPc en miocitos cardíacos neonatales de rata estimulados // Science, 2002, v. 295, pág. 1711-1715.
  55. ↑ Zhang J., Allen MD Biosensores basados ​​en FRET para proteínas quinasas: iluminando el kinoma // Mol. Biosyst., 2007, v. 3, pág. 759-765.
  56. ↑ Shaner NC, Patterson GH, Davidson MW Avances en tecnología de proteínas fluorescentes // J. Cell Sci., 2007, v. 120, pág. 4247-4260.
  57. ↑ Tsien RY, Shaner NC, Campbell RE, Steinbach PA , Giepmans BNG, Palmer AE Proteínas monoméricas fluorescentes rojas, naranjas y amarillas mejoradas derivadas de Discosoma sp. proteína roja fluorescente // Nat. Biotecnología, 2004, v. 22, pág. 1567-1572.
  58. ↑ Tsien RY, Rodriguez E., Campbell R., Lin J. , Lin M. , Miyawaki A. , Palmer A. , Shu X., Zhang J. La creciente y brillante caja de herramientas de proteínas fluorescentes y fotoactivas // Trends Biochem. Sc., 2016, v. 42, pág. 111-129.
  59. ↑ Matz MV, Fradkov AF, Labas YA, Savitsky AP, Zaraisky AG, Markelov ML, Lukyanov SA Proteínas fluorescentes de especies de antozoos no bioluminiscentes // Nat. Biotecnología., 1999, v. 17, pág. 969-973.
  60. ↑ Wall MA, Socolich M., Ranganathan R. La base estructural de la fluorescencia roja en el homólogo tetramérico de GFP DsRed, Nat. Estructura. Biol., 2000, v. 7, pág. 1133-1138.
  61. ↑ Yarbrough D., Wachter RM, Kallio K., Matz MV, Remington SJ Estructura cristalina refinada de DsRed, una proteína roja fluorescente del coral, con una resolución de 2,0 Å // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 2001, v. 98, pág. 462-467.
  62. ↑ Campbell R., Tsien R.Y., Tour. O., Palmer A., ​​​​Steinbach P., Baird GS, Zacharias D. Una proteína fluorescente roja monomérica // Proc. Academia Nacional. ciencia Estados Unidos, 2002, v. 99, pág. 7877-7882.
  63. ↑ Tsien RY, Gonzalez JE Indicadores mejorados del potencial de membrana celular que usan transferencia de energía de resonancia de fluorescencia // Chem. Biol., 1997, v. 4, pág. 269-277.
  64. ↑ Hussain T., Tsien R.Y. et al. El péptido marcado con fluorescencia aumenta la identificación de ramas nerviosas faciales degeneradas durante la cirugía y mejora el resultado funcional // PLoS ONE, 2015, v. 10, e0119600.
  65. ↑ Tsien R.Y. et al. La orientación de laminina de un péptido que resalta los nervios periféricos permite la visualización de nervios degenerados // Proc. nacional Academia ciencia Estados Unidos, 2016, v. 113, pág. 12 774-12 779
  66. ↑ Glasby MA, Gschmeissner SG, Hitchcock RJI, Huang CL-H. La dependencia de la regeneración nerviosa a través de injertos musculares en la rata de la disponibilidad y orientación de la membrana basal // J. eurocytol., 1986, v. 15, pág. 497-510.
  67. ↑ Gattuso JM, Davies AH, Glasby MA, Gschmeissner SE, Huang CL-H. Reparación de nervios periféricos mediante autoinjertos musculares: recuperación de la transmisión en primates // J. Bone Jt Surg. Ser. B, 1988v. 70, pág. 524-529.
  68. ↑ Tsien R.Y. et al. Los eritrocitos marcados con fluorescencia/emisores de positrones 18F permiten obtener imágenes de hemorragia interna en un modelo murino de hemorragia intracraneal // J. Cereb. Blood Flow Metab., 2017, v. 37, pág. 776-786.
  69. ↑ Smith JM, Bradley DP, James MF, Huang CL-H. Estudios fisiológicos de la depresión de propagación cortical // Biol. Rvdo. Camb. Filosofía Soc., 2006, v. 81, pág. 457-481.
  70. ↑ Tsien R.Y. et al. Detección temprana de carcinoma de células escamosas en un modelo de roedor de cáncer oral inducido por carcinógeno mediante péptidos penetrantes de células activables ratiométricos // Oral Oncol., 2017, v. 71, pág. 156-162.
  71. ↑ Tsien RY, Malone CD, Olson ES et al. Detección de tumores a 3 tesla con un dendrímero peptídico de penetración celular activable (ACPPD-Gd), un agente de imágenes moleculares de resonancia magnética (MR) T1 // PLoS ONE. (http://dx.doi.org/10.1371/journal.pone.0137104)
  72. ↑ Tsien R.Y. et al. Radiosensibilización tumoral por monometil auristatina E: mecanismo de acción y entrega dirigida // Cancer Res., 2015, v. 75, pág. 1376-1387.

Enlaces

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