Análisis cuantitativo de ácidos nucleicos : determinación de la concentración de ADN o ARN en una mezcla o preparación pura. Las reacciones que involucran ácidos nucleicos a menudo requieren información precisa sobre la cantidad y la pureza del fármaco. Para determinar la concentración de ácido nucleico en solución, se utiliza un método espectrofotométrico y fluorescencia UV si el ácido nucleico contiene un colorante.
Los ácidos nucleicos absorben la luz ultravioleta de cierta manera . En los espectrofotómetros , la muestra se expone a la luz ultravioleta a una longitud de onda de 260 nm y un fotodetector mide la cantidad de luz que ha pasado a través de la muestra. Cuanta más luz absorbida, mayor será la concentración de ácido nucleico en la muestra.
Usando la ley de Bouguer-Lambert-Beer, es posible correlacionar la concentración de moléculas que absorben radiación con la cantidad de luz absorbida. A una longitud de onda de 260 nm, el coeficiente de extinción promedio para el ADN de doble cadena es 0,020 (μg/mL) -1 cm -1 , para el ADN de cadena sencilla 0,027 (μg/mL) -1 cm -1 , para el ADN de cadena sencilla ARN 0,025 (μg/mL) -1 cm -1 y para oligonucleótidos monocatenarios cortos el coeficiente de extinción depende de la longitud y la proporción de bases nitrogenadas (alrededor de 0,030 (μg/mL) -1 cm -1 ). Por lo tanto, la densidad óptica ( ing. OD, densidad óptica ) igual a 1 corresponde a una concentración de ADN de doble cadena de aproximadamente 50 µg/ml. El método espectrofotométrico para determinar la concentración de ácidos nucleicos se utiliza en concentraciones de hasta 2 OD. [1] Se requieren coeficientes de extinción más precisos para determinar la concentración de oligonucleótidos, y se pueden predecir utilizando el modelo vecino más cercano. [2]
| Tipo de ácido nucleico | Concentración (µg/ml) para 1 unidad A 260 |
|---|---|
| dsDNA (ADN de doble cadena) | cincuenta |
| ssDNA (ADN monocatenario) | 37 |
| ssRNA (ARN monocatenario) | 40 |
Para determinar la concentración de la muestra, la densidad óptica encontrada en una cubeta estándar con un camino óptico de 10 mm debe multiplicarse por el coeficiente apropiado. Por ejemplo, un valor de absorbancia de 0,9 unidades ópticas de ADN bicatenario corresponde a una concentración de 45 μg/ml.
Muchos estudios biológicos ( microarrays de ADN , PCR cuantitativa ) requieren la determinación cualitativa y cuantitativa de pequeños volúmenes de ácidos nucleicos. Los nanofotómetros especiales [3] permiten determinar la concentración de muestras sin la ayuda de una cubeta en volúmenes de submicrolitros, a partir de 0,3 μl. Dado que las mediciones se realizan en una muestra sin diluir, la reproducibilidad de los resultados es muy alta y las muestras en sí pueden utilizarse después del análisis.
Las muestras de ácido nucleico a menudo contienen impurezas de proteínas y otras sustancias orgánicas. La relación de absorbancia a 260 y 280 nm (A 260/280 ) se usa a menudo para evaluar la pureza de una preparación. El ADN puro tiene una relación A 260/280 de aproximadamente 1,8, una muestra de ARN sin impurezas A 260/280 de aproximadamente 2.
Impurezas de proteínas y relación 260:280Para detectar impurezas de proteínas en soluciones de ácidos nucleicos, analice la relación de absorción de las soluciones a longitudes de onda de 260 y 280 nm, ya que los aminoácidos aromáticos de las proteínas absorben a 280 nm [1] [4] . Sin embargo, la influencia de las proteínas de impureza en la determinación de la concentración de ácidos nucleicos es pequeña: solo a una concentración de proteína significativa la relación 260:280 cambia significativamente [1] [5] .
La relación 260:280 permite determinar la mezcla de ácidos nucleicos en soluciones de proteínas y la mezcla de proteínas en soluciones de ácidos nucleicos:
| % ardilla | % ácido nucleico | relación 260:280 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 0.57 |
| 95 | 5 | 1.06 |
| 90 | diez | 1.32 |
| 70 | treinta | 1.73 |
La relación 260:230 es menos sensible al determinar las impurezas de proteínas en una solución de ácido nucleico:
| % ácido nucleico | % ardilla | relación 260:230 |
|---|---|---|
| 100 | 0 | 2.00 |
| 95 | 5 | 1.99 |
| 90 | diez | 1.98 |
| 70 | treinta | 1.94 |
Tales diferencias se deben al mayor valor del coeficiente de extinción molar de los ácidos nucleicos a longitudes de onda de 260 y 280 nm en comparación con las proteínas. Por lo tanto, incluso para una solución de proteínas de una concentración relativamente alta, la contribución a la absorción a longitudes de onda de 260 y 280 nm es pequeña. La contaminación de proteínas en la solución de ácido nucleico no puede determinarse mediante la proporción de 260:230.
Otra contaminaciónPara fines de diagnóstico, a menudo es necesario determinar la cantidad de un ADN o ARN en particular. Se han desarrollado métodos altamente sensibles para la determinación de ADN y ARN en microvolúmenes de muestras, gotas que no superan unos pocos picolitros. Para ello se utilizan dispositivos microfluídicos para PCR con una sola copia del ácido nucleico [7] [8] [9] [10] .