La estreptavidina / ˌstrɛpˈtævɪdɪn / es una proteína ( tetrámero ) de 66,0 kDa , purificada a partir de la bacteria Streptomyces avidinii . _ _ _ _ Los homotetrámeros de estreptavidina tienen una afinidad extremadamente alta por la biotina (también conocida como vitamina B 7 o vitamina H). Con una constante de disociación (K d ) del orden de ≈10 -14 mol/l [1] , la unión de la biotina a la estreptavidina es una de las interacciones no covalentes más fuertes conocidas en la naturaleza. La estreptavidina se usa ampliamente en biología molecular y bionanotecnología debido a la resistencia del complejo estreptavidina-biotina a solventes orgánicos, desnaturalizantes (p. ej ., cloruro de guanidinio ), detergentes (p. ej. , SDS , Triton X-100 ), enzimas proteolíticas y temperaturas y pH extremos.
La estructura cristalina de la estreptavidina unida a la biotina fue descrita por dos grupos en 1989. La estructura se resolvió utilizando difracción anómala de longitud de onda múltiple por Hendrickson et al. [2] en la Universidad de Columbia y usando sustitución isomórfica múltiple por Weber et al. [3] en EI DuPont Central de Investigación y Desarrollo. Hasta septiembre de 2017, se han depositado 171 estructuras en el Protein Data Bank . Vea este enlace para la lista completa . Los extremos N y C de la proteína de 159 residuos de longitud completa se procesan para formar una estreptavidina "núcleo" más corta, que normalmente consta de los residuos 13-139; la eliminación de los extremos N y C es necesaria para lograr la mayor afinidad de unión por la biotina. La estructura secundaria del monómero de estreptavidina consta de ocho hebras β antiparalelas que se pliegan para formar una estructura terciaria de barril β antiparalelo. El sitio de unión de la biotina se encuentra en un extremo de cada barril β. Cuatro monómeros de estreptavidina idénticos (es decir, cuatro tallos β idénticos) se unen para formar la estructura cuaternaria tetramérica de estreptavidina. El sitio de unión de biotina en cada tallo consta de residuos del interior del tallo junto con Trp120 conservado de la subunidad adyacente. Por lo tanto, cada subunidad contribuye al sitio de unión de la subunidad vecina y, por lo tanto, el tetrámero también puede considerarse como un dímero de dímeros funcionales.
Numerosas estructuras cristalinas del complejo estreptavidina-biotina han arrojado luz sobre el origen de esta notable afinidad. En primer lugar, existe una gran complementariedad de forma entre el bolsillo de unión y la biotina. En segundo lugar, existe una extensa red de enlaces de hidrógeno formados con biotina en el sitio de unión. Hay ocho enlaces de hidrógeno directamente a los residuos en el sitio de unión (la llamada "primera capa" de enlaces de hidrógeno), incluidos los residuos Asn23, Tyr43, Ser27, Ser45, Asn49, Ser88, Thr90 y Asp128. También hay una "segunda capa" de enlaces de hidrógeno, incluidos los residuos que interactúan con los residuos de la primera capa. Sin embargo, la afinidad de la estreptavidina por la biotina supera lo que se podría predecir solo a partir de las interacciones de los enlaces de hidrógeno, lo que indica otro mecanismo que contribuye a la alta afinidad [4] . El bolsillo de unión a biotina es hidrofóbico , y existen numerosos contactos mediados por van der Waals e interacciones hidrofóbicas con la biotina cuando está en el bolsillo, lo que también se cree que explica la alta afinidad. En particular, el bolsillo está revestido con residuos de triptófano conservados. Finalmente, la unión de biotina se acompaña de la estabilización de un bucle flexible que conecta las hebras β 3 y 4 (L3/4), que se cierra sobre la biotina unida, actuando como una "tapa" sobre el bolsillo de unión y permitiendo la liberación extremadamente lenta de biotina tasa de disociación.
La mayoría de los intentos de mutar la estreptavidina dan como resultado una disminución de la afinidad de unión a la biotina, lo que es de esperar en un sistema tan optimizado. Sin embargo, se descubrió que un mutante de estreptavidina recién creado llamado traptavidina disocia la biotina más de diez veces más lento, además de una mayor estabilidad térmica y mecánica [5] . Esta disminución en la tasa de disociación fue acompañada por una disminución doble en la tasa de asociación.
La afinidad de unión a la biotina se puede alterar mediante el marcaje químico de la estreptavidina, como con los fluoróforos reactivos con amino ; la flavidina es un mutante de estreptavidina sin cadenas laterales de lisina que retiene buenas características de unión a biotina después de ser marcado con un tinte fluorescente cuando el tinte se acopla al amino terminal [6] .
Entre los usos más comunes de la estreptavidina se encuentra la purificación o detección de diversas biomoléculas. La fuerte interacción de la estreptavidina y la biotina se puede utilizar para unir diferentes biomoléculas entre sí o en un soporte sólido. Se necesitan condiciones estrictas para interrumpir la interacción estreptavidina-biotina, que a menudo desnaturaliza la proteína de interés que se está purificando. Sin embargo, se ha demostrado que una incubación breve en agua por encima de 70 °C interrumpirá de forma reversible la interacción (al menos para el ADN biotinilado) sin desnaturalización de la estreptavidina, lo que permite reutilizar el soporte sólido de estreptavidina [7] . Otra aplicación de la estreptavidina es la purificación y detección de proteínas modificadas genéticamente con el péptido Strep-tag . La estreptavidina se usa ampliamente en inmunotransferencias e inmunoensayos conjugados con algunas moléculas indicadoras, como la peroxidasa de rábano picante . La estreptavidina también se ha utilizado en el campo emergente de la nanobiotecnología , utilizando moléculas biológicas como proteínas o lípidos para crear dispositivos/estructuras a nanoescala . En este contexto, la estreptavidina se puede utilizar como bloque de construcción para unir moléculas de ADN biotinilado para crear andamios a partir de nanotubos de carbono de pared simple [8] o incluso poliedros de ADN complejos [9] . La estreptavidina tetramérica también se ha utilizado como un centro alrededor del cual se pueden colocar otras proteínas mediante una etiqueta de afinidad como Strep-tag o AviTag o mediante fusión genética con SpyTag [10] . La fusión con SpyTag permitió la creación de ensamblajes con 8 o 20 subunidades de estreptavidina. Junto con la sonda de fuerza molecular para estudios de microscopía de fuerza atómica [11] , también se han creado nuevos materiales, como redes cristalinas tridimensionales [12] . La estreptavidina tiene un punto isoeléctrico (pI) débilmente ácido de ~5, pero también está disponible comercialmente una forma recombinante de estreptavidina con un pI casi neutro.
Inmunoterapia predirigidaLa inmunoterapia predirigida utiliza estreptavidina conjugada con un anticuerpo monoclonal contra antígenos específicos del cáncer, seguida de una inyección de biotina radiomarcada para administrar radiación solo a la célula cancerosa. Los obstáculos iniciales incluyen la saturación de los sitios de unión de la biotina en la estreptavidina con biotina endógena en lugar de la biotina radiomarcada administrada, y un alto grado de exposición radiactiva a los riñones debido a las fuertes propiedades de adsorción de la estreptavidina en las células. Ahora se cree que este alto nivel de unión a tipos de células adherentes, como plaquetas activadas y melanomas, es el resultado de la unión de integrinas mediada por la secuencia RYD en la estreptavidina [13] .
La estreptavidina es un tetrámero y cada subunidad se une a la biotina con la misma afinidad. La multivalencia es una ventaja en aplicaciones como la tinción de tetrámeros de MHC , donde los efectos de avidez mejoran la capacidad de las moléculas de MHC unidas a la estreptavidina para detectar células T específicas [14] . En otros casos, como el uso de estreptavidina para visualizar proteínas específicas en las células, la polivalencia puede afectar la función de la proteína de interés. La estreptavidina monovalente es una forma recombinante diseñada de estreptavidina, que es un tetrámero, pero solo uno de los cuatro sitios de unión es funcional. Este único sitio de unión tiene una afinidad de 10-14 mol/l y no puede causar reticulación [15] . Las aplicaciones de la estreptavidina monovalente han incluido el seguimiento de la fluorescencia de los receptores de la superficie celular , la decoración del origami de ADN y la actuación como puntero para identificar áreas específicas para la criomicroscopía electrónica .
La estreptavidina monomérica es una forma recombinante de estreptavidina con mutaciones para dividir el tetrámero en monómero y aumentar la solubilidad de la subunidad aislada resultante. Las versiones monoméricas de la estreptavidina tienen una afinidad por la biotina de 10 −7 mol/l 10 −8 mol/l y, por lo tanto, no son ideales para el etiquetado, pero son útiles para la purificación donde se desea la reversibilidad [16] [17] .
BivalenteLa estreptavidina con exactamente dos sitios de unión a biotina por tetrámero se puede preparar mezclando subunidades con y sin un sitio de unión a biotina funcional y purificando mediante cromatografía de intercambio iónico . Los sitios de unión funcionales aquí tienen la misma estabilidad de unión a biotina que la estreptavidina de tipo salvaje. La estreptavidina divalente con dos sitios de unión de biotina juntos (cis-bivalente) o por separado (trans-bivalente) se puede purificar por separado [18] .
TrivalenteTambién se puede preparar estreptavidina con exactamente tres sitios de unión a biotina por tetrámero utilizando el mismo principio que para las estreptavidinas divalentes [19] .
Estreptavidinas de alta valenciaSe han generado estreptavidinas de mayor valencia utilizando la química de conjugación de enlaces isopeptídicos utilizando la tecnología SpyTag/SpyCatcher [20] . Esto sugiere un tetrámero de estreptavidina con tres sitios de unión a biotina y estreptavidina muerta fusionada con SpyTag o SpyCatcher. Cuando se mezclan diferentes tetrámeros, se forma un enlace covalente que proporciona más sitios de unión a la biotina. Con este método, se crearon seis y doce sitios de unión a biotina por molécula.
La estreptavidina no es la única proteína que puede unirse a la biotina con gran afinidad. La avidina es la otra proteína de unión a biotina más conocida. Aislada originalmente de la yema de huevo, la avidina tiene solo un 30% de identidad de secuencia con la estreptavidina, pero una estructura secundaria, terciaria y cuaternaria casi idéntica. La avidina tiene una mayor afinidad por la biotina ( Kd ~ 10–15 M ), pero a diferencia de la estreptavidina, la avidina está glicosilada, cargada positivamente y tiene actividad pseudocatalítica (la avidina puede mejorar la hidrólisis alcalina del enlace éster entre la biotina y el nitrofenilo). grupo) y tiene una mayor tendencia a la agregación. Por otro lado, la estreptavidina es el mejor aglutinante para el conjugado de biotina; la avidina tiene una afinidad de unión menor que la estreptavidina cuando la biotina se conjuga con otra molécula, a pesar de que la avidina tiene una mayor afinidad por la biotina libre no conjugada. Debido a que la estreptavidina no tiene ninguna modificación de carbohidratos y tiene un pI casi neutro , tiene la ventaja de una unión no específica mucho más baja que la avidina. La avidina desglicosilada (NeutrAvidin) es más comparable en tamaño, pI y unión no específica a la estreptavidina.
Grupos que investigan y desarrollan proteínas de la familia de las estreptavidinas o avidinas (en orden alfabético)