Fluorescencia de clorofila

La fluorescencia de clorofila es el fenómeno de la luminiscencia de la clorofila cuando absorbe luz, se produce como consecuencia del retorno de la molécula del estado excitado al estado fundamental. Es ampliamente utilizado como indicador de la conversión de energía fotosintética en plantas superiores , algas y bacterias . La clorofila excitada pierde la energía luminosa absorbida, desperdiciándola en la fotosíntesis (conversión de energía fotoquímica o extinción fotoquímica), convirtiéndola en calor como resultado de la extinción no fotoquímica o emitiéndola en forma de fluorescencia. Dado que todos estos procesos compiten entre sí, al analizar la fluorescencia de la clorofila, uno puede hacerse una idea sobre la intensidad de la fotosíntesis y la salud de la planta [1] .

Efecto Kautsky

Después de la iluminación de las hojas adaptadas a la oscuridad, se puede observar un rápido aumento en la fluorescencia del Fotosistema II (PSII) seguido de una lenta disminución. Este fenómeno fue descrito por primera vez por H. Kautsky y A. Hirsch en 1931. El efecto se denominó efecto Kautsky en honor a su descubridor.

El aumento de la fluorescencia se debe a que los centros de reacción del fotosistema II (PSII) pasan a un estado "cerrado". Se dice que un centro de reacción está "cerrado" cuando ya no puede transferir electrones. Esto ocurre cuando el transportador de electrones aguas arriba ha sido restaurado y aún no ha transferido sus electrones al siguiente aceptor de electrones. El cierre de los centros de reacción reduce la eficiencia global de las reacciones fotoquímicas (kP) y, por lo tanto, aumenta el nivel de fluorescencia (kF). La transferencia abrupta de la hoja del estado oscuro al claro aumenta la proporción de centros de reacción PSII cerrados y conduce a un aumento de la fluorescencia durante los primeros 1-2 segundos. Más tarde, la fluorescencia se debilita lentamente, este proceso puede durar varios minutos. La caída se debe a la activación del "apagado fotoquímico" y la transferencia de electrones desde el PSII a través de la ETC de los cloroplastos al NADP y al ciclo de fijación del carbono, así como a la inclusión de mecanismos de apagado no fotoquímicos , que convierten la energía de excitación en calor. .

Mediciones de fluorescencia

Las mediciones comienzan con la determinación del nivel de fondo de fluorescencia , que se mide exponiendo la hoja a un breve destello de luz de baja intensidad (para dispositivos PAM), insuficiente para causar una reacción fotoquímica (todos los centros de reacción están abiertos), y por lo tanto conduce completamente a fluorescencia [2] . $F_{0}$

Para utilizar la medición de la fluorescencia de la clorofila para analizar la fotosíntesis, los investigadores deben distinguir entre extinción fotoquímica y extinción no fotoquímica (generación de calor). Esto se logra deteniendo las reacciones fotoquímicas, lo que permite a los investigadores medir la fluorescencia solo en presencia de extinción no fotoquímica. Para hacer esto, la planta se ilumina intensamente con un fuerte destello de luz o se lleva a la luz después de la adaptación a la oscuridad. Hay un cierre temporal de todos los centros de reacción del PSII y la energía no se transfiere a lo largo de la cadena transportadora de electrones. La extinción no fotoquímica no tiene efecto si el flash es lo suficientemente corto. Durante un destello (o después de una exposición repentina de la planta a la luz de la oscuridad), los centros de reacción se saturan de luz con una transición a un estado cerrado. En tales condiciones, cuando no hay extinción fotoquímica, y la extinción fotoquímica no es insignificantemente pequeña, la fluorescencia alcanza su nivel máximo, designado como el máximo de fluorescencia [2] . $F_{m}$

La efectividad de la extinción fotoquímica, que determina la eficiencia de PSII, se puede evaluar comparándola con el nivel estacionario de fluorescencia en la luz y el nivel de fondo de fluorescencia en ausencia de luz adecuada para la fotosíntesis. La eficiencia del enfriamiento no fotoquímico varía según varios factores internos y externos. Su fortalecimiento conduce a un aumento en la liberación de calor y una disminución en . Dado que es imposible detener por completo la disipación de energía térmica, es imposible medir la fluorescencia de la clorofila en ausencia total de extinción no fotoquímica. Por lo tanto, los investigadores utilizan el punto de adaptación a la oscuridad ( ) con el que comparan el valor calculado de extinción no fotoquímica [2] . $F_{m}$ $Pie$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\displaystyle F_{m}^{0))$

Parámetros generales de fluorescencia

$F_{0}$ : Fluorescencia mínima (en unidades relativas). Nivel de fluorescencia en condiciones en las que se supone que todos los centros de reacción están abiertos (adaptación a la oscuridad).

$F_{m}$ : Fluorescencia máxima (en unidades relativas). Nivel de fluorescencia en destellos de alta intensidad. Todos los centros de reacción se consideran cerrados.

${\ estilo de visualización {F_ {0))'}$ : Fluorescencia mínima (en unidades relativas) en condiciones de adaptación a la luz. El nivel de fluorescencia de la muestra irradiada, que se reduce en comparación con debido a la presencia de extinción no fotoquímica. $F_{0}$

${F_{m))'$ : Fluorescencia máxima (en unidades relativas) en condiciones de adaptación a la luz. Nivel de fluorescencia de una muestra irradiada con pulsos de luz saturados que cubren temporalmente todos los centros de reacción del PSII.

${\ Displaystyle F_ {tr}}$ : Fluorescencia terminal (en unidades relativas). Apagado de la fluorescencia al final de la prueba.

$T_{{1/2}}$ : La mitad del tiempo de subida de a . $F_{0}$ $F_{m}$

Parámetros de diseño

${\ Displaystyle F_ {v}}$ : Fluorescencia variable. Calculado como = - [3] . ${\ Displaystyle F_ {v}}$ $F_{m}$ $F_{0}$

${\tfrac{F_{v}}{F_{m}}}$ : Relación de fluorescencia variable y fluorescencia máxima. Calculado como . [4] . Es una medida de la máxima eficacia del PSII (si todos los centros estuvieran abiertos). se puede utilizar para evaluar la eficacia potencial de PSII cuando las muestras se miden en condiciones de adaptación a la oscuridad. ${\displaystyle {\frac{F_{m}-F_{0}}{F_{m))))$ ${\tfrac{F_{v}}{F_{m}}}$

${\ estilo de visualización qP}$ : Apagado fotoquímico. este parámetro da una estimación aproximada de la proporción de sitios de reacción PSII abiertos. Calculado como [5] . ${\frac {{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'-{F_{0}}'}}$

${\ estilo de visualización \ Phi _ {PSII}}$ : Eficiencia de las reacciones fotoquímicas del fotosistema II. Calculado como = [6] . Este parámetro indica la proporción de luz absorbida por PSII que se utilizó en reacciones fotoquímicas. Como tal, puede dar una medida de la tasa de transporte lineal de electrones y, por lo tanto, caracteriza toda la fotosíntesis como un todo. $Y_{(II)}$ ${\tfrac{{F_{m}}'-F}{{F_{m}}'}}$

${\ estilo de visualización \ Phi _ {PSII}}$ da una estimación de la eficiencia de la fotosíntesis y nos dice qué procesos afectan la eficiencia. El cierre de los centros de reacción como resultado de una alta intensidad de luz cambiará el valor . Los cambios en la eficiencia de la extinción no fotoquímica cambiarán la relación . ${\ estilo de visualización qP}$ ${\tfrac{F_{v}}{F_{m}}}$ ${\ estilo de visualización qP}$ ${\tfrac{F_{v}}{F_{m}}}$

Uso práctico

Eficiencia del fotosistema II como medida de la fotosíntesis

La fluorescencia de clorofila se usa para medir el nivel de fotosíntesis, pero en esencia, esto es una simplificación excesiva. La fluorescencia se puede usar para medir la eficiencia de la fotoquímica del PSII, que se puede usar para estimar la tasa de transporte lineal de electrones al multiplicar por la intensidad de la luz. Sin embargo, cuando los investigadores dicen "fotosíntesis", por lo general se refieren a la fijación de carbono . El transporte de electrones y la fijación de CO 2 tienen una correlación bastante buena, pero es posible que esto no se observe en el campo debido a procesos competitivos como la fotorrespiración , el metabolismo del nitrógeno y la reacción de Mehler .

Relación entre el transporte de electrones y la fijación de dióxido de carbono

Medir la fluorescencia de la clorofila y el intercambio de gases simultáneamente para obtener una imagen completa de cómo responden las plantas a su entorno requiere una técnica de investigación seria y sofisticada. Un método consiste en medir simultáneamente la fijación de CO2 y las reacciones fotoquímicas del PSII a diferentes intensidades de luz en condiciones que suprimen la fotorrespiración . Los gráficos de fijación de CO 2 y las reacciones fotoquímicas del PSII permiten calcular el número de electrones necesarios para la asimilación de una molécula de CO 2 . Con base en esta evaluación, es posible estimar el nivel de fotorrespiración . Este método se utiliza para investigar la importancia de la fotorrespiración como mecanismo fotoprotector durante la sequía.

Sobradu (2008) [7] estudió el intercambio de gases y la fluorescencia de la clorofila en respuesta a una alta intensidad de luz en especies pioneras y forestales. Al mediodía se midió el intercambio gaseoso de las hojas con la medición del nivel total de fotosíntesis y la concentración intercelular de CO 2 ( ). En las mismas hojas se midieron los parámetros de fluorescencia de la clorofila (fondo ; máximo ; y variable, ). Los resultados mostraron que, a pesar de que las especies pioneras y las forestales se originan en diferentes hábitats, ambas mostraron una susceptibilidad similar a la fotoinhibición del mediodía . $C_{yo}$ $F_{0}$ $F_{m}$ ${\ Displaystyle F_ {v}}$

Medición de los niveles de estrés y resiliencia

La fluorescencia de clorofila permite medir el nivel de estrés de las plantas. Por su nivel, se puede juzgar el nivel de exposición a los estreses abióticos, ya que las temperaturas extremas, la iluminación excesiva y la sequía afectan negativamente el metabolismo de las plantas. Esto, a su vez, conduce a un desequilibrio entre la absorción de energía luminosa por parte de la clorofila y el uso de esta energía en el proceso de fotosíntesis [8] .

Favaretto et al. (2010) [9] estudiaron la adaptación a la luz alta en especies pioneras y de sucesión tardía cultivadas en condiciones de 100 % (sol) y 10 % (sombra) de luz normal. Se encontró que la disminución a plena luz era mayor en las especies de sucesión tardía que en las especies pioneras. En general, estos resultados indican que las especies pioneras crecen mejor a plena luz que las especies de sucesión tardía, lo que sugiere que tienen una alta tolerancia al daño fotooxidativo. ${\tfrac{F_{v}}{F_{m}}}$
Neocleous y Vasilakakis (2009) [3] investigaron la respuesta de las frambuesas al estrés por boro y sal . Usando un fluorómetro, midieron , y . La fluorescencia de la clorofila foliar no dependió significativamente de la concentración de NaCl cuando la concentración de boro era baja. Cuando se aumentó la concentración de boro, la fluorescencia de la clorofila de las hojas disminuyó en las mismas condiciones de salinidad. Se puede concluir que el efecto combinado del boro y el NaCl en las frambuesas provoca un efecto tóxico, afectando los parámetros fotoquímicos. $F_{0}$ $F_{m}$ ${\ Displaystyle F_ {v}}$

Índice de balance de nitrógeno

Dada la relación entre la clorofila y el contenido de nitrógeno en las hojas, el contenido de clorofila se puede utilizar para detectar la deficiencia de nitrógeno en las plantas. Hay varios métodos diferentes para esto.

Resultó que es posible juzgar el metabolismo del nitrógeno de las plantas por el nivel de polifenoles . Cuando la planta está en condiciones óptimas, favorece el metabolismo normal y la síntesis de proteínas (principal forma de nitrógeno biológico), clorofilas y una pequeña cantidad de flavonoides (metabolitos secundarios). Por otro lado, en caso de deficiencia de nitrógeno, hay una mayor producción de flavonoides [10] .

El índice de balance de nitrógeno le permite evaluar el contenido de nitrógeno en condiciones naturales mediante el cálculo de la proporción entre clorofila y flavonoides.

Medición del contenido de clorofila

Gitelson (1999) postuló: “La relación entre la fluorescencia de la clorofila a 735 nm y en el rango de longitud de onda de 700 nm a 710 nm está relacionada linealmente con el contenido de clorofila (con un coeficiente de determinación r2 superior a 0,95) y, por lo tanto, puede utilizarse como un indicador preciso del contenido de clorofila en las hojas de las plantas. [once]

Fluorómetros

El desarrollo de los fluorómetros ha hecho que la medición de la fluorescencia de la clorofila sea un método común en la fisiología vegetal. La invención de la técnica de modulación de amplitud de pulso (PAM) [ 12 ] [ 13] y la aparición del primer fluorímetro de pulso comercial o PAM-fluorímetro PAM-101 (Walz, Alemania ) supusieron una revolución en el análisis de la fluorescencia de la clorofila. ). Al modular la amplitud del haz de luz de medición (rango de pulso de microsegundos) y al mismo tiempo detectar la fluorescencia excitada, es posible determinar el rendimiento relativo de fluorescencia (Ft) en presencia de luz dispersa. Fundamentalmente, esto significa que la fluorescencia de la clorofila se puede medir en el campo incluso bajo la luz solar directa [2] .

Algunos fluorímetros de destello pueden determinar tanto los parámetros de luz como los parámetros de adaptación a la oscuridad (F o , F m , F o ', F m ', F v /F m , Y, F t , F oq ) y pueden calcular los coeficientes de extinción fotoquímica. -extinción fotoquímica (qP, qL, qN, Y(NO), Y(NPQ) y NPQ). Algunos fluorómetros son completamente portátiles y se manejan con una sola mano.

El desarrollo de un sistema de imágenes ha facilitado la determinación de falta de homogeneidad espacial en muestras fotosintéticamente activas. Estas heterogeneidades ocurren en las hojas de las plantas, por ejemplo, debido a crecimientos, diversos estreses ambientales o un agente infeccioso. El conocimiento de las faltas de homogeneidad de la muestra es esencial para la correcta interpretación de las mediciones de la productividad fotosintética de la muestra. La alta calidad de imagen brinda la capacidad de analizar una sola célula o incluso un solo cloroplasto, así como áreas que cubren hojas o plantas enteras.

Enfoques alternativos

Sensores LIF

Los métodos basados en el efecto Kautsky no agotan toda la variedad de métodos para medir la fluorescencia de la clorofila. En particular, los avances recientes en la fluorescencia inducida por láser (LIF) brindan la oportunidad de desarrollar sensores lo suficientemente compactos y eficientes para la determinación del estado fotofisiológico y la evaluación de la biomasa. En lugar de medir el flujo de fluorescencia total, estos sensores registran la densidad óptica de este flujo excitado por fuertes pulsos de láser de nanosegundos. Este método no requiere 15-20 min de adaptación a la oscuridad (como es el caso de los métodos basados en el efecto Kautsky [14] ) y permite excitar la muestra desde una distancia considerable. Los sensores LIF pueden proporcionar evaluaciones rápidas y de distancia bastante larga.

Véase también

Apagado no fotoquímico

Notas

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↑ 1 2 Efectos del boro y la salinidad en la frambuesa roja in vitro - International Journal of Fruit Science . Informaworld.com (3 de diciembre de 2008). Consultado: 28 de marzo de 2011.
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