La calponina ( ing. Calponin ) es un miembro de la familia de proteínas de unión a actina, típica principalmente de las células del músculo liso que se unen a la actina G y F. Las calponinas son el producto de 3 genes y se dividen en las denominadas α-calponina (h1 o básica, 292 a.k. , 34 kDa), β-calponina (252 a.k.) - que es el producto del mismo gen que la α-calponina , pero con una deleción de aminoácidos en el segmento 216-256. Otras dos isoformas, la calponina neutra (calponina h2) y la calponina ácida, se expresan en el músculo liso y en las células no musculares. Otros representantes de las calponinas son SM22 y transgelina. Calponin toma su nombre del dominio CH o Calponin Homology, presente entre muchas ABP ( proteínas de unión a actina ). A pesar de este hecho , la calponina no se une a la actina a través de este sitio (Gimona y Mital, 1998), sino que se une a los lípidos (Bogatcheva y Gusev, 1995; Fujii et al., 1995). Se cree que el sitio de unión a actina (Mezgueldi et al., 1992) está ubicado en la región entre el dominio CH y las repeticiones de tipo calponina (CLIK - repetición de tipo calponina). La calponina es termoestable. El peso molecular de la isoforma de músculo liso es de 34 kDa. Otros tejidos presentan isoformas de calponina más ácidas que no se unen al calcio , pero se unen a la calmodulina . La unión de Ca 2+ /calmodulina inhibe la unión a la actina. La fosforilación de la calponina por las serina-treonina quinasas produce un efecto similar . La calponina también tiene un sitio de unión a la tropomiosina .
La calponina es una proteína de unión a actina, calmodulina y tropomiosina que se ha encontrado en los tejidos del músculo liso de varios vertebrados y en algunas células no musculares. Durante la preparación de filamentos delgados de estómago de pollo , se demostró que contienen actina, tropomiosina, caldesmon y calponina en una relación molar de 7:0,9:0,6:0,7. Al igual que caldesmon, la calponina inhibe la actividad de la actomiosina ATPasa en solución, deslizando la actina en relación con la miosina fosforilada in vitro , y esta inhibición es desencadenada por Ca 2+ /calmodulina. La inhibición es abolida por la fosforilación de proteínas in vitro . Estas propiedades sugieren que la calponina puede ser un regulador adicional de las interacciones actina-miosina.
La digestión quimotríptica completa o parcial de la calponina se lleva a cabo a 25°C utilizando una proporción en peso de proteasa a sustrato de 1:100 o 1:1000, respectivamente, en imidazol - HCl 10 mM, NaCl 30 mM , MgCl2 2 mM , 4 mM NaN3 , pH 7,0, en ausencia o presencia de F-actina (4 mg/ml) (relación molar actina/calponina = 3:1). A intervalos de tiempo apropiados (0-60 min), se mezclan cantidades bien definidas de proteínas con un volumen igual de tampón de muestra en ebullición de Laemmli y se preparan para electroforesis en gel . Para las reacciones de entrecruzamiento y los experimentos de unión, la digestión se termina con fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 2,5 mM . La hidrólisis total del complejo covalente calponina-actina (11 mg/ml) con CNBr (67 mg/ml añadidos en dos cantidades iguales) se lleva a cabo durante 24 horas en ácido fórmico al 70% que contiene β-mercaptoetanol 14 mM.
Calponina (0,7-1,3 mg/ml) en imidazol-HCl 10 mM, NaCl 30 mM, MgCl2 2 mM, NaN3 4 mM, pH 7,0, mezclada con actina F nativa o escindida con subtilisina (2,4-4,5 mg/ml) ( relación molar calponina/actina = 1:3) en presencia de EDC 2 mM y NHS 5 mM. La reacción se llevó a cabo a 25°C durante 0-30 min y se controló mediante electroforesis en gel SDS. Caldesmon (1,4 mg/ml) se entrecruza con F-actina en las mismas condiciones usando una relación molar de proteína de 1:6. El enlace covalente entre la F-actina y el fragmento quimotríptico de calponina NH2-terminal de 22 kDa se obtiene de la siguiente manera: 60 minutos de digestión quimotríptica de calponina, en una proporción en peso de enzima a sustrato de 1:1000, se complementa con F-actina en una relación molar de 1:3, después de la centrifugación a 180.000 x g durante 1 hora a 4°C, el sedimento se resuspende en tampón de imidazol-HCl, pH 7,0. Para la separación preparativa del aducto de F-actina-calponina de 76 kDa de la calponina no reticulada, una solución de F-actina-calponina reticulada (110 mg de proteína) obtenida tras 45 min de reacción se ajustó en β-mercaptoetanol 3 mM, dializada durante la noche a 4°C frente a tampón despolimerizante (Tris-HCl 50 mM, KI 0,6 mM, tiosulfato de sodio 5 mM, ATP 0,5 mM , CaCl2 0,5 mM y β-mercaptoetanol 0,5 mM, pH 7,5), y luego el gel se filtra a través de una columna de Sephacryl-S-300 (1,6 x 120 cm), equilibrada a 4°C en el mismo tampón. Las fracciones de proteína iniciales se eluyen con un aducto de 76 kDa desprovisto de calponina libre, según se analiza mediante electroforesis en gel. Las fracciones agrupadas se dializan con agua destilada, se liofilizan y se someten a digestión con CNBr .