La evolución sistemática de ligandos por enriquecimiento exponencial ( en inglés SELEX de Systematic Evolution of Ligands by EXPonential Enrichment ) es un método de química combinatoria utilizado en biología molecular para obtener oligonucleótidos (moléculas cortas de ARN o ADN monocatenario ) que se unen específicamente a un ligando específico (o ligandos). Dichos oligonucleótidos se denominan aptámeros [1] [2] [3] . En la mayoría de los casos, este método se llama SELEX, pero también hay abreviaturas SAAB (del sitio de unión seleccionado y amplificado en inglés - sitio de unión seleccionado y amplificado ) y CASTing (del inglés. amplificación cíclica y selección de objetivos - amplificación cíclica y selección de objetivos) [4] [5] . SELEX fue desarrollado en 1990. En 2015, el Journal of Molecular Evolution dedicó un número especial a este método en relación con el 25 aniversario de su invención [6] .
El proceso comienza con la síntesis de una biblioteca muy grande de oligonucleótidos, que consta de secuencias aleatorias de longitud fija con regiones 5' y 3' constantes que sirven como sitios de hibridación de cebadores (es decir, unión complementaria de cebadores a la plantilla). Además, los oligonucleótidos incluidos en la biblioteca interactúan con el ligando de interés para el investigador (la mayoría de las veces , una proteína o un pequeño compuesto orgánico ). Los oligonucleótidos que no pudieron unirse al ligando se eliminaron mediante cromatografía de afinidad o perlas magnéticas [7] . Los oligonucleótidos unidos al ligando se eluyen, se amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y se someten a rondas posteriores de selección para seleccionar las moléculas con la mayor afinidad por el ligando [2] [3] .
El método SELEX ya se ha utilizado con éxito para desarrollar varios aptámeros con fines clínicos y de investigación [8] . SELEX también se ha utilizado para generar aptámeros con nucleótidos que contienen azúcares modificados químicamente o bases nitrogenadas . Los nucleótidos modificados pueden proporcionar aptámeros con capacidades de unión adicionales y también aumentar su estabilidad [9] .
El primer paso de SELEX es la creación de una gran biblioteca de oligonucleótidos con una longitud fija, pero con secuencias total o parcialmente aleatorias. Sin embargo, las regiones de secuencia variable deben estar flanqueadas por regiones de secuencia fija para ser amplificadas por PCR. Los oligonucleótidos se preparan inicialmente mediante síntesis química y luego se amplifican mediante PCR para que cada secuencia aleatoria esté presente en múltiples copias en la biblioteca. En el caso de los aptámeros de ARN, se lleva a cabo la transcripción in vitro de secuencias aleatorias. El alto número de copias de cada secuencia aleatoria reduce la probabilidad de que se pierda un sitio de unión potencial debido a razones estocásticas. Para que los oligonucleótidos puedan adquirir una estructura espacial nativa, se convierten en una forma monocatenaria y solo después se incuban con el ligando objetivo [2] [3] [10] .
Inmediatamente antes de agregar los oligonucleótidos al ligando, la biblioteca de oligonucleótidos monocatenarios se calienta y se enfría lentamente para que adquieran una estructura secundaria y terciaria termodinámicamente estable [3] [7] . A continuación, la biblioteca de secuencias aleatorias (biblioteca aleatoria) se incuba con el ligando diana inmovilizado para permitir que los aptámeros se unan a él. Los protocolos para incubar una biblioteca con un ligando pueden variar, en particular, se pueden usar diferentes enfoques para inmovilizar ligandos, separar oligonucleótidos no unidos, diferentes tiempos y temperaturas de incubación, tampones de incubación y proporciones de concentración de oligonucleótidos y ligandos. Los ligandos se inmovilizan en columnas de cromatografía de afinidad [3] , filtros de nitrocelulosa [2] o perlas magnéticas [7] . También se ha desarrollado una variante de SELEX que utiliza la célula entera como ligando . En este caso, la incubación de la biblioteca de oligonucleótidos ocurre directamente en las placas de cultivo en las que crecen las células [11] . La composición del tampón en el que tiene lugar la incubación depende de las propiedades del ligando y de los requisitos para los aptámeros seleccionados con éxito. Por ejemplo, si el ligando es una proteína o molécula pequeña cargada negativamente , se utilizan tampones con alto contenido de sal para promover la unión del aptámero al ligando. Si se requiere obtener un aptámero que se una a una proteína in vivo o a una célula completa, que se planea usar con fines diagnósticos o terapéuticos , entonces se usan tampones para la incubación que están cerca del plasma sanguíneo en concentraciones de sal , y el proceso en sí se lleva a cabo a temperaturas fisiológicas para que los aptámeros seleccionados tengan más probabilidades de unirse al ligando precisamente in vivo . Los tampones de incubación también pueden contener competidores no específicos. Si existe una alta probabilidad de que los oligonucleótidos que no se unen al ligando permanezcan en la mezcla de reacción debido a una unión no específica a la plantilla, entonces los competidores no específicos (moléculas pequeñas o polímeros similares en propiedades a los oligonucleótidos de la biblioteca) prevenir la retención no específica de aptámeros inadecuados en la mezcla de reacción [11] . Las propiedades de los aptámeros seleccionados también pueden depender de la proporción de concentraciones de ligando y oligonucleótido. Si el investigador no se enfrenta a la tarea de obtener aptámeros con una afinidad muy fuerte por el ligando, entonces vale la pena usar un exceso del ligando para aumentar la probabilidad de que al menos algunos oligonucleótidos puedan unirse a él. Sin embargo, si, por el contrario, se requiere un aptámero altamente específico que se una fuertemente al ligando, entonces se deben tomar oligonucleótidos en exceso. Esto creará competencia entre aptámeros y condiciones para la selección de los más adecuados [2] .
Después de que la biblioteca de oligonucleótidos se haya incubado con el ligando durante un tiempo suficiente, los oligonucleótidos no unidos se eliminan por lavado, mientras que los unidos permanecen unidos al ligando inmovilizado [3] . Cuando se eliminan las secuencias no unidas, es necesario eluir los aptámeros unidos rompiendo su enlace con el ligando inmovilizado. Para la elución, se crean condiciones desnaturalizantes en las que los aptámeros pierden su estructura espacial, pierden sus enlaces con el ligando y se lavan con agua desionizada [3] . Las condiciones desnaturalizantes son creadas por soluciones que contienen urea o EDTA [11] [12] , así como por altas temperaturas o impacto físico. Después de la elución, los oligonucleótidos liberados se someten a transcripción inversa si son ARN o si es necesario introducir nucleótidos modificados [2] [3] [11] , y los nucleótidos de ADN simplemente se ensamblan para una mayor amplificación [13] . Los fragmentos de ADN obtenidos se amplifican aún más mediante PCR y se convierten en ADN monocatenario (ssDNA), ARN u oligonucleótido de base modificada, que se utilizará para la siguiente ronda de selección [2] [3] .
El siguiente paso en SELEX es obtener ssDNA, que se utilizará para una mayor amplificación mediante PCR. Una de las formas más sencillas de obtener ssDNA es usar cebadores inversos biotinilados para PCR, por lo que las cadenas de ADN complementarias sintetizadas llevarán biotina. Con la ayuda de la biotina, se pueden fijar a la resina y la segunda hebra del dúplex se puede eluir con una solución alcalina . Otro método para obtener ssDNA es la PCR asimétrica , en la que el cebador directo se toma en exceso y el cebador inverso se toma en una cantidad muy pequeña, por lo que se sintetizan más fragmentos monocatenarios. Una desventaja de la PCR asimétrica es que después de la PCR, el producto monocatenario debe eliminarse del ADN bicatenario y otros fragmentos extraños. Las cadenas innecesarias se pueden destruir enzimáticamente , habiéndolas marcado previamente para que sea reconocida, por ejemplo, por la exonucleasa lambda . Las enzimas destruirán la hebra innecesaria y el ssDNA objetivo permanecerá intacto [2] [3] .
Para aumentar la especificidad de los aptámeros seleccionados con SELEX, se puede introducir un paso adicional, la selección negativa, inmediatamente antes o inmediatamente después de la incubación. Este paso es necesario para eliminar las secuencias de la mezcla que no se unen al ligando, sino a la matriz en la que está inmovilizado [12] [14] [13] . La selección negativa consiste en añadir a la mezcla análogos de ligandos, proteínas no específicas y otras moléculas, que recogen todos los oligonucleótidos no específicos [11] [13] [15] .
Para monitorear el progreso de SELEX, se puede comparar el número de moléculas de ligando que interactúan con los aptámeros, que está relacionado con el número de oligonucleótidos eluidos, con el número total de oligonucleótidos teóricamente eluidos en cada paso. El número de oligonucleótidos eluidos se calcula midiendo la absorbancia a una longitud de onda de 260 nm o utilizando oligonucleótidos marcados con fluorescencia . Cuando el proceso SELEX llega a su fin, la proporción de oligonucleótidos que se unen al aptámero alcanza el 100 % y el número de oligonucleótidos eluidos se vuelve igual (o ligeramente inferior) al tamaño de la biblioteca utilizada en la incubación [3] [16 ]. ] .
Actualmente, SELEX utiliza nucleótidos modificados químicamente. La presencia de nucleótidos modificados químicamente en los oligonucleótidos puede proporcionar ventajas adicionales a los aptámeros potenciales, como aumentar su estabilidad y resistencia a las nucleasas , mejorar la unión a objetivos específicos, cambiar las propiedades físicas (por ejemplo, aumentar la hidrofobicidad ) y aumentar el número de posibles alteraciones espaciales. estructuras para un oligonucleótido dado. Los nucleótidos con bases nitrogenadas no naturales ya se han utilizado en SELEX, y en algunos casos, gracias a su uso, fue posible obtener aptámeros de ADN con alta afinidad por el objetivo [8] [9] [17] .
SELEX fue diseñado para producir, mediante evolución dirigida, aptámeros con una afinidad muy alta por ligandos específicos, incluidas moléculas pequeñas como ATP [18] y adenosina [10] [19] , así como proteínas (por ejemplo, priones [20] y factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) [21] ). SELEX se utiliza para generar aptámeros de alta afinidad para estructuras más complejas como las células tumorales [22] . Se están desarrollando aptámeros que se unen específicamente a marcadores tumorales [23] , proteína fluorescente verde y fluoróforos relacionados [24] . La FDA ya ha aprobado un aptámero de unión a VEGF conocido como pegaptanib para el tratamiento de la degeneración macular [21] [25] . SELEX se ha utilizado para producir ADN catalítico altamente específico (enzimas de ADN). Se conocen varios inviernos de ADN específicos de metales [26] , incluidos los inviernos de ADN específicos del cobre [27] , el uranio [28] y el sodio [29] . Se están desarrollando biosensores basados en aptámeros [30] ; además, está previsto que se utilicen para el marcaje fluorescente de proteínas [31] y células [32] , así como para la inhibición selectiva de enzimas [33] .