Estabilidad (resistencia) a los medicamentos antimicóticos : la ausencia de acción fungistática o fungicida del antimicótico sobre el hongo. Se encontró resistencia a la acción de los fármacos antifúngicos de primera línea en todos los principales patógenos de micosis humanas profundas y superficiales, incluida Candida spp. , Aspergillus spp. [1] , Cryptococcus spp. [2] , Trichophyton spp. [3] , pero su prevalencia varía de un país a otro. La resistencia es uno de los factores que afectan la efectividad de la terapia antifúngica, junto con la presencia de enfermedades subyacentes, el cumplimientopaciente, las características individuales del sistema inmunológico del paciente y la calidad del medicamento .
Si el genoma del hongo contiene mutaciones que provocan una disminución de la eficacia de un antimicótico, se habla de su resistencia microbiológica . El valor de corte epidemiológico (ECOFF ) es la concentración de un antimicótico que permite separar las cepas salvajes de las mutantes. La resistencia clínica es la capacidad de un hongo para sobrevivir y multiplicarse bajo la influencia de dosis terapéuticas de antimicóticos, que in vivo se expresa en la ineficacia de la terapia antifúngica [4] .
La diferenciación de cepas y tipos de hongos en sensibles y resistentes al evaluar tanto la resistencia microbiológica como clínica a los antimicóticos se lleva a cabo mediante la evaluación de las concentraciones umbral mínimas. La concentración umbral mínima (MIC) es la concentración mínima de un antimicótico que resulta en la inhibición del crecimiento fúngico en un experimento in vitro . La inhibición del crecimiento fúngico al alcanzar la CIM del antimicótico (efecto fungistático) no indica que el antimicótico a la concentración deseada tenga efecto fungicida. Para evaluar este último, es necesario determinar la concentración mínima de fungicida , que a menudo supera la CIM. La presencia de resistencia clínica en un aislado se evalúa comparando la MIC de un antimicótico con los valores de umbral clínico ( English Clinical Breakpoint, CBP ). Los umbrales clínicos se establecen relacionando la CIM de un fármaco para un agente infeccioso particular con su farmacocinética y experiencia clínica real [5] .
Los conceptos de resistencia clínica y microbiológica de los hongos a los antimicóticos no son sinónimos: por ejemplo, algunas cepas mutantes que portan determinantes genéticos de resistencia pueden no mostrar fenotípicamente un aumento suficiente en el nivel de resistencia, expresado en CIM, lo que caracterizará a la cepa como clínicamente sensible. Además, en la ciencia experimental, la resistencia se entiende a veces como la capacidad de un aislado de un hongo para crecer en presencia de una concentración de un fármaco antifúngico que inhibe el crecimiento de otros aislados de la misma especie [6] .
Hay tres métodos principales que se utilizan para las pruebas de susceptibilidad manuales: el método de difusión en disco, el método de dilución en serie y el Etest. También existen sistemas automatizados que le permiten determinar la sensibilidad de la levadura, por ejemplo, Vitek 2 (BioMerier), o levaduras y mohos, por ejemplo, Sensititre (BioVitrum). Los estándares de prueba de susceptibilidad antimicótica son desarrollados por el Comité Europeo para Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST) y el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorio (CLSI) . Dado que la actividad de los antimicóticos contra varios micromicetos varía, en muchos casos es posible predecir de manera confiable la resistencia del patógeno determinando su especie.
Las líneas genéticas de hongos, independientemente de su estatus taxonómico -genérico, específico o intraespecífico- pueden caracterizarse por diferentes niveles de sensibilidad a los antimicóticos. Por ejemplo, Clavispora lusitaniae de tipo salvaje es sensible a dosis elevadas de fluconazol, pero Candida ( Clavispora ) auris generalmente no lo es [7] . La resistencia natural de este último puede explicarse por la presencia de ciertos aminoácidos en las regiones Erg11 conservadas, que en los aislados de Candida albicans aparecen solo como resultado de la adaptación al fármaco [8] . La introducción de la secuencia CYP51A del hongo de las mucosas Rhizopus arrhizus en el genoma de Aspergillus fumigatus , que es sensible a fluconazol y voricanazol , conduce al desarrollo de la resistencia característica de rhizopus en Aspergillus [9] . Por lo tanto, la resistencia natural de Rhizopus arrhizus a estos azoles puede estar asociada con características estructurales de Cyp51A. Una de las líneas clonales de C. albicans detectada por secuenciación multilocus mostró una asociación con la resistencia a la fluorocitosina y la terbinafina [10] . Para el complejo de especies Trichophyton mentagrophytes / T. interdigitale , se conocen alrededor de 15 genotipos de la región ITS, pero en la abrumadora mayoría de los casos, se observa resistencia en aislamientos de tipo VIII [11] .
El desarrollo de resistencia a los antimicóticos ocurre debido a la acumulación de mutaciones en el genoma del micromiceto bajo la presión selectiva del fármaco antifúngico. Los espectros de tales mutaciones son diferentes para cada clase de antimicóticos. Los aislados del genotipo sensible pueden adquirir un fenotipo estable cuando se incorporan a la biopelícula [12] .
Los mecanismos por los que se desarrolla la resistencia a los azoles se comprenden mejor en Candida albicans [13] , pero es muy probable que los dos primeros enumerados a continuación sean comunes a todos los hongos de importancia médica [14] [15] .
Exportación activa: los azoles se pueden eliminar de la célula aumentando la expresión de los transportadores de membrana, lo que evita que el fármaco alcance una concentración suficiente para inhibir Erg11 con éxito. Dos familias de transportadores están involucradas en este proceso: los factores de facilitación del transporte MFS (p. ej ., MDR1 ) y los transportadores ABC (p. ej ., CDR1 y CDR2 ). Se produce un aumento en la expresión de genes que codifican transportadores de membrana debido a mutaciones en los genes de factores de transcripción. Curiosamente, los experimentos con aislados de tipo salvaje pertenecientes al complejo de especies de C. haemulonii no revelaron un aumento en la expresión de los genes de bomba de membrana en presencia de fluconazol o voriconazol [16] .
Modificación de la diana: el gen ERG11 puede mutarse de tal forma que la lanosterol 14α-desmetilasa codificada por él pierde su afinidad por los azoles. A partir de 2010, se ha demostrado experimentalmente que al menos 9 sustituciones de aminoácidos en la proteína Erg11 contribuyen al desarrollo de resistencia a los azoles mediante : ERG11 amplificada de C. albicans , c) detección de afinidad reducida de lanosterol 14α-desmetilasa por azol [17] . En los hongos del género Aspergillus , el gen de la lanosterol 14α-desmetilasa se designa como CYP51 . Aspergillus fumigatus tiene dos de sus parálogos , CYP51A y CYP51B , el desarrollo de resistencia ocurre debido a la acumulación de mutaciones en CYP51A y un aumento en el número de repeticiones de nucleótidos en su promotor [18] . Tres parálogos de CYP51 están presentes en el genoma de A. flavus , y se encuentran mutaciones que potencialmente confieren resistencia en CYP51A y CYP51C [19] .
Un aumento en la expresión del gen diana del azol, lanosterol 14α-desmetilasa, puede llevar a que sea imposible alcanzar una concentración antimicótica que inhiba el crecimiento de la cepa, y la síntesis de ergosterol continuará. Se produce por mutaciones en el gen del factor de transcripción correspondiente, que aumentan la afinidad de la propia molécula reguladora por el potenciador del gen ERG11 .
Sin intermediario tóxico: cuando se inhibe Erg11, la célula acumula un intermediario metilado, 14α-metilfecosterol. Este compuesto es utilizado como sustrato por la Δ5-6-desaturasa Erg3, produciendo un producto tóxico. Se encontraron cepas con mutaciones homocigóticas del gen ERG3 , que provocan la pérdida de funcionalidad de la proteína Erg3. Por lo tanto, estas cepas no convierten los compuestos metilados en compuestos tóxicos, lo que explica su resistencia a los azoles [20] . Esta falta de Erg3 funcional generalmente se combina con la resistencia a la anfotericina B, ya que la ausencia de Δ5-6-desaturasa bloquea la vía biosintética del ergosterol.
pérdida de heterocigosidad. En las levaduras diploides del género Candida pueden aparecer mutaciones que provocan resistencia en uno de los dos cromosomas homólogos. Con la pérdida de heterocigosidad, el alelo con el determinante de resistencia se encuentra en el estado homocigoto y su efecto se potencia [21] .
Aneuploidía. Los aislados de levadura resistentes a los azoles a menudo tienen un cariotipo aberrante [22] [23] . En un estudio de 2015, los aislamientos clínicos de C. albicans obtenidos de pacientes con candidiasis oral tenían reordenamientos cromosómicos inestables. No hubo una correlación significativa con el nivel de resistencia a los azoles [21] . Sin embargo, en un artículo más reciente de 2021, en una de las cepas de C. auris estudiadas, la duplicación de un segmento del cromosoma 1 que contenía ERG11 fue la única mutación que podría explicar la CIM elevada de fluconazol. En otra cepa, una duplicación de todo el cromosoma 5 que contenía el gen del factor de transcripción TAC1b fue la única explicación posible para el aumento de 32 veces en la CIM de fluconazol [24] . En experimentos sobre el cultivo de Cryptococcus neoformans en presencia de fluconazol, se demostró una correlación entre el número de disomías de varios cromosomas diferentes y la CIM del fármaco. Después de la transferencia de las cepas a un medio que no contenía fluconazol, se perdieron copias adicionales de los cromosomas y se restableció la sensibilidad inicial al fluconazol [25] .
Formación de biopelículas. Ser parte de las biopelículas va acompañado de una serie de efectos reversibles.
En 2020, la resistencia microbiológica a la terbinafina generalmente se asocia con mutaciones en el gen ERG1 de la escualeno epoxidasa . A pesar de esto, algunos de los aislados resistentes tienen una secuencia ERG1 de tipo salvaje , por lo que existen otros mecanismos para la aparición de resistencia a este antimicótico [11] .
El objetivo de las equinocandinas es la enzima β-1,3-D-glucano sintasa, que es responsable de la síntesis del componente de la pared celular . La resistencia a las equinocandinas se desarrolla debido a la aparición de sustituciones de aminoácidos en esta enzima, y en hongos del género Candida , la parte principal de los cambios se limita a dos regiones del polipéptido, los llamados "puntos calientes" [29] .
Las razones de la aparición de resistencia incluyen el uso no sistemático de medicamentos antimicóticos. La desviación de la dosis y el régimen del fármaco, optimizado para el efecto clínico, le da al hongo la oportunidad de adaptarse a la existencia en presencia del fármaco. El principal mecanismo para la aparición de mutaciones puntuales son los errores de la ADN polimerasa, y una alta población de células fúngicas que se dividen activamente se asocia con una alta probabilidad de desarrollar resistencia. Por lo tanto, es más probable que la aspergilosis pulmonar crónica , en la que es posible la esporulación, se complique con la resistencia a los medicamentos en comparación con las formas extrapulmonares [30] . Dado que los cuerpos extraños en el cuerpo humano son un buen sustrato para el crecimiento de biopelículas, se recomienda retirar o reemplazar los catéteres intravasculares dentro de las primeras 24 horas de la detección de la candidemia [31] .
Los agentes antifúngicos no aumentan la tasa del proceso de mutación, ya que la ausencia de un efecto mutagénico es un requisito previo para el lanzamiento de cualquier fármaco al mercado. Por lo tanto (1) las mutaciones en el genoma fúngico ocurren espontáneamente; (2) además, se produce una reproducción selectiva de portadores de mutaciones que favorecen la supervivencia [32] .
Si la resistencia de las bacterias está determinada en parte por genes ubicados en plásmidos y otros elementos genéticos móviles , esto no es típico de los hongos. Además, la transferencia horizontal de genes en hongos es rara [33] [34] . Por lo tanto, la resistencia a los hongos se propaga exclusivamente con cepas resistentes. El tema de la transmisión de cepas resistentes de Candida spp. La transmisión de persona a persona a través del contacto sexual es controvertida [35] [36] pero la posibilidad de transmisión materna a un recién nacido está bien establecida [37] . Lo mismo se aplica a Trichophyton spp., de transmisión sexual [38] . Dado que una proporción significativa de los fármacos antimicóticos tienen una estructura química similar a la de los fungicidas agrícolas, las tierras agrícolas pueden ser una fuente de aislamientos resistentes en las lesiones pulmonares causadas por los hongos del moho [39] .
Los cambios mutacionales destinados a aumentar la resistencia del hongo a los antimicóticos pueden conducir a un aumento de su virulencia . Por lo tanto, las mutaciones en el gen del factor de transcripción PDR1 responsable del aumento de la expresión de los genes de bomba de membrana en Candida glabrata se asociaron con una disminución en la eficiencia de absorción de las células de levadura por parte de los macrófagos [40] .
Cuando se prueba la susceptibilidad in vitro de aislados de micromicetos , se pueden observar varios fenómenos inusuales. La tolerancia a los antifúngicos es una característica de las cepas sensibles a los fármacos que tienen la capacidad de crecer lentamente a concentraciones inhibidoras del fármaco; por lo general, sólo algunas de las células de una población determinada presentan este crecimiento lento [6] . Igual que el crecimiento final [41 ] . La heterorresistencia es un término clínico para los aislamientos que contienen pequeñas subpoblaciones de células (generalmente <1 %) que tienen la capacidad de crecer en concentraciones de fármaco al menos ocho veces la MIC para la gran mayoría de las células susceptibles de la población. El crecimiento paradójico es la capacidad de un hongo aislado para volver a crecer en presencia de altas concentraciones de un fármaco, pero ser completamente susceptible a concentraciones más bajas. El crecimiento paradójico aparece con un retraso de uno a varios días, pero se parece al crecimiento en ausencia del fármaco. El crecimiento paradójico se ha informado principalmente en presencia de equinocandinas . A partir de 2020, la importancia clínica y los mecanismos moleculares de estos fenómenos siguen sin comprenderse bien [6] .
Los mecanismos de resistencia adquirida a los antimicóticos más comunes son diversos, lo que dificulta el desarrollo de sistemas de prueba para el diagnóstico molecular. Sin embargo, existen varios esquemas de PCR para detectar mutaciones en los genes FKS1 y FKS2 de aislados de C. glabrata que confieren resistencia a las equinocandinas [42] . Además, se ha propuesto un sistema de prueba PCR para detectar una mutación en ERG1 responsable de la resistencia de T. mentagrophytes a la terbinafina [43] . Para Aspergillus fumigatus , hay un ejemplo de cómo el descubrimiento de nuevos mecanismos de resistencia [44] puso en duda la aplicabilidad de un sistema de prueba desarrollado previamente centrado en la detección directa de mutaciones funcionales [45] .