Determinación de la conformación cromosómica

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La captura de conformación cromosómica ,  a menudo abreviada como 3C ( captura de conformación cromosómica , 3C ) [1]  es un conjunto de métodos de biología molecular utilizados para estudiar la organización espacial de la cromatina en el núcleo celular . Se utilizan para cuantificar las interacciones entre loci genómicos ubicados uno al lado del otro en un espacio tridimensional [2] .

Tales interacciones pueden surgir como consecuencia de funciones biológicas, por ejemplo, entre un promotor y un potenciador , o como resultado de bucles aleatorios de polímeros , cuando el movimiento físico de la cromatina provoca una “colisión” de loci [3] . Al mismo tiempo, los elementos reguladores pueden ubicarse a una distancia de varios millones de pares de bases de los genes que controlan [4] . A pesar de que la región de control del locus se encuentra a una distancia de varias decenas de kilobases de los genes, la conformación compleja de la región de ADN entre ellos les permite interactuar directamente entre sí, controlando así la expresión génica [5 ] .

Las frecuencias de interacción pueden analizarse directamente [6] o convertirse en distancias y usarse para reconstruir estructuras tridimensionales [7] .

Las principales diferencias entre los métodos basados ​​en 3C son sus capacidades y alcance [8] . La secuenciación profunda de material derivado de 3C también permite el mapeo de interacciones en todo el genoma.

Historia

Históricamente , la microscopía ha sido el principal método para estudiar la organización nuclear [9] .

En 1984, John T. Lees desarrolló el método de inmunoprecipitación de cromatina , cuyos principios se utilizan en varios métodos 3C. En 2002, Job Dekker propuso la idea de utilizar una matriz de densidad de frecuencia de interacciones entre loci para determinar la organización espacial de los genomas. Esta idea fue la base para el desarrollo del método 3C, cuyo primer artículo fue publicado en 2002 por Job Dekker y la profesora Nancy Klöckner en la Universidad de Harvard [10] [11] . Luego, en 2006, Marike Simonis desarrolló el método 4C [12] y Josie Dosti desarrolló el método 5C [13] . Métodos más desarrollados como ChIP-seq [14] , Hi-C [15] y ChIA-pet [16] .

Métodos experimentales

Todos los métodos de fijación de la conformación cromosómica comienzan con un conjunto similar de manipulaciones en la etapa inicial, realizadas en una muestra de células. Los siguientes son los pasos principales del método clásico 3C.

  1. Procesamiento con formaldehído [17] , que entrecruza regiones genómicas adyacentes y proteínas en el espacio, congelando así las interacciones entre loci. Muy a menudo, se utiliza formaldehído al 1-3% para la fijación durante 10-30 minutos a temperatura ambiente [18] . El tiempo de reacción y la concentración están limitados porque un entrecruzamiento excesivo puede interferir con la restricción en el siguiente paso.
  2. Fragmentación por endonucleasas de restricción ( enzimas de restricción ). La resolución final está determinada por el tamaño de los fragmentos. Para ello se utilizan restrictasas de división media, que reconocen y cortan 6 pb. Por ejemplo, EcoR1 o HindIII : cortan el genoma una vez cada 4000 pb. Así, cuando se utiliza una enzima de restricción de corte medio, es posible obtener alrededor de 1 millón de fragmentos diferentes del genoma humano [18] [19] .
  3. Ligadura aleatoria , que se realiza a bajas concentraciones de ADN utilizando T4 ADN ligasa [20] . Como resultado, se unen los extremos de aquellas secciones de ADN que se entrecruzaron con formaldehído. Las concentraciones bajas proporcionan especificidad de ligadura (solo entre fragmentos que interactúan entrecruzados). Posteriormente, los loci que interactúan se cuantifican amplificando los fragmentos ligados por PCR [18] [20] .
  4. Creación de una biblioteca par 3C . El tratamiento térmico conduce a la ruptura de enlaces y la formación de fragmentos de ADN quimérico lineal. Como resultado, se creará una biblioteca de fragmentos de ADN que interactúan (biblioteca 3C) [21] .
  5. La PCR en tiempo real permite evaluar la probabilidad de interacción entre dos regiones específicas del genoma. Los cebadoresseleccionande tal manera que cada cebador sea complementario a su locus correspondiente. En caso de interacción, ambos cebadores se hibridan y el fragmento se amplifica [8] .

Métodos básicos

3C

La captura de conformación cromosómica ( 3C ) es necesaria para cuantificar la interacción entre un par seleccionado de loci genómicos .  Por ejemplo, 3C se puede utilizar para explorar posibles interacciones promotor-potenciador. Los fragmentos ligados se detectan mediante PCR utilizando cebadores para secuencias conocidas [10] [2] .

4C

El método de captura de conformación cromosómica cerrada ( inglés  captura de conformación cromosómica circularizada , 4С ) cubre las interacciones entre un locus seleccionado y otros loci genómicos. Se utiliza para encontrar la región del genoma que interactúa con una secuencia de ADN determinada [22] y es una combinación del método 3C estándar con PCR invertida .

Los primeros 4 pasos coinciden con los pasos del método de fijación de la conformación cromosómica. A continuación, se lleva a cabo secuencialmente la fragmentación de la biblioteca 3C resultante con enzimas de restricción; ligadura para ciclar fragmentos de ADN, lo que da como resultado una biblioteca de ADN quimérico "circular" (biblioteca 4C) [23] . La PCR invertida permite la amplificación de una secuencia desconocida usando una secuencia conocida ligada a ella [12] . El análisis de la biblioteca 4C se lleva a cabo utilizando micromatrices de ADN .

A diferencia de 3C y 5C, los métodos 4C no requieren un conocimiento previo de las secuencias de nucleótidos de ambas regiones cromosómicas que interactúan [8] . Los resultados obtenidos con 4C son altamente reproducibles para la mayoría de las interacciones entre regiones proximales. Se pueden analizar alrededor de un millón de interacciones en un solo microchip [1] .

5C

5C detecta interacciones entre todos los fragmentos en una región dada, y el tamaño de esta región generalmente no excede una megabase. Le permite buscar regiones de ADN que interactúan con varias regiones seleccionadas del genoma y es una combinación del método 3C y PCR multiplex [13] .

Los primeros 4 pasos coinciden con los pasos del método de fijación de la conformación cromosómica. A continuación, los adaptadores se ligan secuencialmente a todos los fragmentos usando ligasa Taq; el análisis de la biblioteca 5C se lleva a cabo utilizando micromatrices de ADN y secuenciación [21] . 5C es útil para estudiar interacciones complejas, sin embargo, tiene una cobertura relativamente baja. El método no es adecuado para estudiar interacciones complejas en todo el genoma, ya que esto requeriría millones de cebadores 5C [8] .

Hi-C

El método Hi-C contiene pasos adicionales destinados a enriquecer la biblioteca resultante con fragmentos que contienen información sobre contactos de ADN en la célula, es decir, fragmentos quiméricos. Después de la restricción, se realiza la biotinilación de los extremos del ADN, luego la ligación y luego los nucleótidos biotinilados se eliminan de los extremos de las moléculas de ADN. Como resultado, la biotina contiene solo aquellos fragmentos de ADN que han sufrido todas las reacciones anteriores. Luego, dichas moléculas se separan de aquellas que no entraron estadísticamente en una de las reacciones, utilizando la unión específica de biotina por estreptavidina.. Después de preparar la biblioteca de los fragmentos resultantes,alto rendimientopara determinar la secuencia de nucleótidos de los fragmentos quiméricos[15]. Las secuencias que componen estas moléculas se mapean de forma independiente en el genoma, lo que permite determinar en qué partes del genoma se encuentran y, en consecuencia, qué partes del genoma interactúan en la célula. Por lo tanto, se verifican todas las posibles interacciones por pares entre las regiones del genoma[24].

Los científicos están tratando de establecer los límites de aplicabilidad del método Hi-C utilizando el ejemplo de un estudio sobre la detección de tumores cerebrales primarios [25] . Antes de la detección del cáncer, Hi-C se usaba principalmente para trabajar con líneas celulares [26] .

Métodos Especiales

Los métodos específicos incluyen métodos basados ​​en captura de secuencias, métodos unicelulares y métodos basados ​​en inmunoprecipitación. Por ejemplo, Hi-C de una sola célula se puede utilizar para estudiar interacciones en células individuales [24] .

Los métodos basados ​​en la captura de secuencias utilizan la fijación de oligonucleótidos para enriquecer bibliotecas de loci de interés 3C y Hi-C [27] . Estos incluyen: Capture-C [28] , NG Capture-C [29] , Capture-3C [30] y Capture Hi-C [31] . Estos métodos logran una mayor resolución y sensibilidad que los métodos basados ​​en 4C [8] .

Los métodos basados ​​en la inmunoprecipitación permiten aislar loci que interactúan con la ayuda de proteínas específicas, como factores de transcripción o proteínas aislantes [32] . Entre ellos se encuentran métodos como ChIP-loop y ChIA-PET. ChIP-loop combina 3C con ChIP-seq para detectar una interacción entre dos loci de interés mediada por la proteína de interés [33] . ChIA-PET combina Hi-C y ChIP-seq para detectar todas las interacciones mediadas por la proteína de interés [16] [2] .

Importancia biológica

Los métodos 3C contribuyeron a una gran cantidad de importantes descubrimientos biológicos, incluidos nuevos datos sobre las características estructurales de los cromosomas, la clasificación de los bucles de cromatina y también ayudaron a profundizar el conocimiento sobre los mecanismos de regulación de la transcripción (cuya violación puede conducir a una serie de enfermedades ) [9] .

Los métodos de captura de conformación cromosómica han demostrado la importancia de la proximidad espacial de los elementos reguladores de genes. Por ejemplo, en tejidos que expresan genes de globina, la región de control del locus de globina β forma un bucle junto con estos genes. Al mismo tiempo, el bucle está ausente en los tejidos donde este gen no se expresa [34] .

La fijación de la conformación de los cromosomas permitió detectar un gran nivel de su organización, los llamados TAD ( dominios asociados topológicamente ), que se correlacionan con cambios en los marcadores epigenéticos. Algunos TAD no muestran actividad transcripcional, mientras que la actividad de otros está suprimida [35] . Se ha encontrado una gran cantidad de TAD en D. melanogaster , ratones y humanos [36] . El factor de transcripción CTCF y el complejo proteico cohesina desempeñan el papel principal en la determinación de las interacciones entre TAD, potenciadores y promotores . Los resultados de los experimentos 3C apuntan a la importancia de la orientación cara a cara de los motivos de unión de CTCF y el bucle potenciador-promotor. Esto es necesario para el posicionamiento correcto del potenciador en relación con su objetivo [37] .

Enfermedades humanas

Hay una serie de enfermedades causadas por defectos en la interacción promotor-potenciador [38] . Estos incluyen una enfermedad de la sangre como la beta-talasemia , que ocurre como resultado de una eliminación del elemento potenciador de LKO [39] [40] . Una mutación en el potenciador SBE2, que a su vez atenúa la expresión del gen SHH [41] conduce al desarrollo de holoprosencefalia . Al mismo tiempo, se interrumpe la formación del telencéfalo, dividido en hemisferios. Otro ejemplo de una enfermedad asociada con la expresión alterada de SHH es la polidactilia tipo 2 PPD2 (pulgar trifalángico). Surge de una mutación del elemento regulador ZRS, que afecta al aumento de la producción de SHH [42] . Un desorden en las interacciones entre el promotor y el potenciador afecta no solo a las malformaciones, sino que también puede causar enfermedades oncológicas. Por lo tanto, el adenocarcinoma de pulmón puede desarrollarse debido a la duplicación del elemento potenciador del gen MYC [43] . La leucemia linfoblástica aguda de células T puede estar causada por la aparición de un nuevo potenciador debido a una mutación en la secuencia del intrón [44] .

Análisis de datos

Los datos resultantes de diferentes experimentos 3C se caracterizan por una estructura y propiedades estadísticas diferentes. Por lo tanto, para procesar cada tipo de experimento, existe un paquete de software [27] .

Los datos de Hi-C se utilizan a menudo en el análisis de los niveles de organización de la cromatina en todo el genoma. Como resultado del procesamiento de los algoritmos existentes, se distinguen los TAD, que son regiones lineales extendidas del genoma que están relacionadas espacialmente [45] [35] [6] .

Hi-C y sus derivados se mejoran constantemente. Fit-Hi-C [3]  es un método basado en el principio del agrupamiento de datos discretos. Sus modificaciones son posibles teniendo en cuenta la distancia de interacción (refinamiento del spline inicial o spline-1) y refinamiento del modelo cero (spline-2). El resultado de Fit-Hi-C es una lista de interacciones intracromosómicas por pares con los valores p y q correspondientes [46] .

La organización 3D del genoma se puede establecer mediante la descomposición espectral de la matriz de contacto. Cada vector propio corresponde a un conjunto de loci con propiedades estructurales comunes (estos loci no necesitan estar dispuestos linealmente uno tras otro) [47] .

Uno de los factores de confusión para la tecnología 3C son las frecuentes interacciones no específicas entre loci que resultan del comportamiento aleatorio del polímero. La especificidad de la interacción entre los dos loci debe necesariamente confirmarse en el nivel apropiado de significancia estadística [3] .

Normalización del mapa de contactos de Hi-C

Hay dos formas principales de normalizar los datos de mapa de calor de contacto de Hi-C sin procesar. El primero es el supuesto de igual disponibilidad, lo que significa que cada posición en el cromosoma tiene la misma posibilidad de participar en una interacción. En consecuencia, la verdadera señal del mapa de contacto Hi-C debe ser una matriz balanceada (una matriz balanceada es aquella para la cual las sumas de valores en filas y columnas son iguales). Un ejemplo de dicho algoritmo es el algoritmo de Sinhorn-Knopp , que reduce el mapa de contacto preliminar a una matriz equilibrada [48] .

Otro método utiliza la suposición de que se asocia algún sesgo con cada posición cromosómica. El valor del mapa de contacto para cada coordenada será igual a la señal verdadera para esa posición multiplicada por las compensaciones de las dos posiciones adyacentes. Los algoritmos que utilizan un modelo sesgado incluyen el algoritmo de corrección iterativo. Durante su ejecución, el sesgo de fila y columna se elimina iterativamente del mapa de contactos primario [47] .

Análisis de motivos de ADN

Los motivos de ADN  son secuencias cortas específicas, a menudo de 8 a 20 nucleótidos de largo [49] , que están sobrerrepresentadas estadísticamente en un conjunto de secuencias con una función biológica común. Por el momento, los motivos reguladores de las interacciones de largo alcance de la cromatina aún no han sido suficientemente estudiados [50] .

Análisis de los genomas del cáncer

Las técnicas basadas en métodos 3C pueden arrojar luz sobre los reordenamientos cromosómicos en los genomas del cáncer [25] . Además, son capaces de mostrar cambios en la proximidad espacial de los elementos reguladores y sus genes diana, lo que permite una comprensión más profunda de la organización estructural y funcional del genoma en su conjunto [51] .

Véase también

Notas

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