Cromatina abierta ( cromatina abierta en inglés ) - pequeñas áreas de cromatina , libres de nucleosomas [1] . La siembra de nucleosomas generalmente se previene mediante factores proteicos asociados a la cromatina que reconocen ciertas secuencias de ADN . Estas proteínas incluyen factores de transcripción , ADN o ARN polimerasas . La cromatina abierta a menudo coincide con secuencias reguladoras en cis , a saber: promotores , potenciadores , aislantes , silenciadores , sitios de origen de la replicación del ADN [2] . El tamaño de las secciones abiertas de la cromatina suele ser de varios cientos de pares de bases , con un promedio de alrededor de 300 pb [3] .
La cromatina abierta se determina con mayor frecuencia mediante el método de sensibilidad a la ADNasa. Las regiones libres de nucleosomas de la cromatina son atacadas preferentemente por la ADNasa I cuando se tratan con ella células permeabilizadas o núcleos aislados . En este sentido, la cromatina abierta a menudo se denomina sitios hipersensibles a la ADNasa I o sitios hipersensibles . La probabilidad de que la nucleasa rompa el ADN en sitios hipersensibles puede superar la media en cientos e incluso miles de veces. La hipersensibilidad a la cromatina abierta DNasa I debe distinguirse del aumento de la sensibilidad general a la DNasa de los genes transcritos activamente [4] .
Dependiendo del tipo de factores proteicos cuya unión al ADN impide el aterrizaje del nucleosoma, las regiones de cromatina hipersensibles a la ADNasa I pueden ser específicas de tejido o constitutivas, es decir, presentes en células diferenciadas a lo largo de diferentes vías.
Para mapear áreas de cromatina abierta, se utilizan la sensibilidad a la DNasa ( DNasa I hipersensible ) y el aislamiento de elementos reguladores mediante formaldehído . Aislamiento de elementos reguladores asistido por formaldehído (FAIRE) [1] . El método de sensibilidad de la ADNasa no permite determinar qué sitio regulador es esta área de cromatina abierta [1] .
Previamente, el análisis de los resultados del método de sensibilidad a la ADNasa se llevó a cabo usando hibridación de transferencia Southern ( ing. Southern blot ). Esto no nos permitió analizar una gran cantidad de sitios, así como encontrar nuevos sitios de hipersensibilidad. El análisis de sensibilidad de la ADNasa también se puede realizar mediante PCR en tiempo real (PCR cuantitativa). Esto es mucho más simple que la hibridación de transferencia de Southern, pero este método también tiene un número limitado de sitios para el análisis y no se puede utilizar para un estudio de todo el genoma de la distribución de los sitios de sensibilidad a la DNasa I [5] .
El desarrollo de secuenciación de alto rendimiento y métodos de micromatrices de ADN hace posible mapear regiones de cromatina abierta en todo el genoma [ 6 ] . Además, la combinación del método de sensibilidad a la DNasa con el método de inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP) seguido de una secuenciación de alto rendimiento proporciona más información sobre la unión de factores de transcripción específicos a sitios activos de cromatina [1] .
Otra forma de mapear áreas de cromatina abierta es realizar inmunoprecipitación de cromatina ( ChIP ) para anticuerpos contra histonas . Al mismo tiempo, las regiones de cromatina abierta deberían estar pobremente representadas, ya que los nucleosomas no están asociados con ellas. El método de sensibilidad a la ADNasa y la inmunoprecipitación de histonas dan resultados similares [7] .
En los genomas eucariotas , las secuencias no codificantes involucradas en la regulación de la expresión génica en diferentes etapas de desarrollo de un organismo o en diferentes tejidos son de particular importancia. El descubrimiento y caracterización de las regiones reguladoras se vuelve esencial para comprender los patrones en la expresión génica [5] . Entonces, en el genoma humano , más del 95% del ADN no codifica . Esta clase de secuencias, además del ADN basura , incluye importantes secuencias reguladoras: promotoras, potenciadoras, silenciadoras, aislantes o control loci ( locus controlregions (LCR) ) . El consorcio ENCODE ha demostrado que los sitios de hipersensibilidad a la ADNasa I identificados en el 1 % del genoma humano son marcadores de modificaciones de histonas , sitios de replicación temprana , sitios de inicio de la transcripción y sitios de unión de factores de transcripción [8] . Además, la cromatina abierta a menudo se asocia con ARN no codificantes transcritos activamente [8] .
Además de las secuencias reguladoras no codificantes, la cromatina abierta también se asocia con exones e intrones de genes transcritos activamente. Especialmente a menudo tales áreas de cromatina abierta coinciden con el primer exón y el primer intrón del gen [5] . Sin embargo, la presencia de cromatina abierta no es una condición suficiente para la actividad génica. Los genes no transcritos asociados con la cromatina abierta están en un estado de "preparación" para la transcripción ( estado de equilibrio en inglés ) [5] . Así, la formación de cromatina abierta o la transición a un estado inactivo es importante para la regulación de la expresión génica.
No solo los sitios de unión de los factores de transcripción y otras proteínas reguladoras pueden estar libres de nucleosomas. Algunas secuencias de ADN no pueden envolver los glóbulos nucleosómicos. Estas son secuencias que tienen una flexibilidad reducida y secuencias que tienden a crear estructuras no canónicas, como horquillas [9] .
La captura de pantalla del navegador de UCSC muestra la colocalización de un sitio de grupos de hipersensibilidad a DNaseI con promotores de dos genes. Las áreas de cromatina abierta están rodeadas por histonas H3 [ acetiladas en el residuo de lisina 27 ( H3K27Ac), que es una marca para regiones reguladoras de cromatina activa, como promotores y potenciadores. Además, en la región del sitio de hipersensibilidad de la DNasa, hay un sitio de unión para muchos factores de transcripción, entre los que se encuentra el factor de iniciación de la transcripción conservado TBP (es la parte principal de TFIID ). También puede notar la unión frecuente en esta región de la ARN polimerasa II , que lleva a cabo la transcripción de genes codificadores de proteínas en humanos . Este sitio de hipersensibilidad a la DNasa se caracteriza por un mayor conservadurismo entre los mamíferos ( Ing. Mammal Cons ), lo que significa que esta secuencia se conserva durante la evolución y, como resultado, su significado funcional [8] .
La formación de regiones libres de nucleosomas ocurre bajo la acción de factores especiales que llevan a cabo el ensamblaje, desensamblaje y movimiento de los nucleosomas. El proceso de cambiar la posición de los nucleosomas se llama remodelación de la cromatina . Se trata de complejos de remodelación de la cromatina, complejos proteicos conservadores que funcionan con el consumo de energía del ATP . La remodelación de la cromatina se lleva a cabo después de la introducción de ciertas marcas epigenéticas : modificación de histonas o metilación del ADN . Si las marcas corresponden a cromatina activa (por ejemplo, novena lisina acetilada de la histona H3, cuarta lisina dimetilada y trimetilada de la histona H3 y muchas otras), entonces se forman áreas de cromatina abierta. A menudo, el perfil de las modificaciones de las histonas tiene una distribución definida alrededor del sitio de hipersensibilidad a la ADNasa I [5] .
Métodos altamente eficientes permiten comparar la distribución de regiones de cromatina abierta en diferentes tejidos o cultivos celulares de un mismo organismo. Tal comparación revela una diferencia significativa en la distribución de dichas regiones en el genoma [5] . Esto indica una actividad diferente de tales sitios en diferentes tejidos. Por lo tanto, el promotor y el potenciador de un gen pueden ubicarse en la región abierta de la cromatina en un tejido y estar cerrados por nucleosomas en otro. Esto indica una expresión génica diferente en diferentes tejidos y es más característico de los genes específicos de tejido . Por el contrario, los genes que se encuentran en la región de cromatina abierta en todos los tejidos y líneas celulares se denominan genes de mantenimiento . El perfil de sensibilidad a la ADNasa también puede cambiar durante el desarrollo y la diferenciación celular. Para identificar la actividad de genes específicos de tejido, utilice la definición de ontología génica ( ing. Gene Ontology (GO) ) después de realizar DNase-seq [5] .