La secretómica es una sección de la proteómica que estudia todas las proteínas secretadas por una célula , tejido u organismo [1] . Las proteínas secretadas no solo están involucradas en muchos procesos fisiológicos diferentes, incluida la transducción de señales celulares y la remodelación de la matriz extracelular , sino que también son una parte integral de la invasión y metástasis de las células malignas [2] . La secretómica es, por lo tanto, importante para identificar biomarcadores de cáncer .
En 2000, Tjalsma et al., acuñaron el término secreto en su trabajo sobre la bacteria Bacillus subtilis . El secretoma se definió como la totalidad de todas las proteínas secretadas y el aparato secretor de una bacteria. Utilizando una base de datos de secuencias de proteínas de B. subtilis y un algoritmo que comprueba los sitios de hidrólisis característicos de las proteínas secretadas y los péptidos señal N-terminales , pudieron predecir la cantidad de proteoma secretado por la célula [3] . En 2001, el mismo laboratorio estableció el estándar para la secretomia: las predicciones basadas en una sola secuencia de aminoácidos no son suficientes para definir un secretoma. Utilizaron electroforesis 2D y espectrometría de masas para identificar 82 proteínas secretadas por B. subtilis , de las cuales solo 48 se predijeron en función de la secuencia de aminoácidos mediante el método descrito en su trabajo anterior [4] .
La comprensión de que hay muchas rutas de secreción no tradicionales y que muchas proteínas no secretadas son parte de la ruta secretora tradicional ha creado la necesidad de una definición más profunda del secretoma. En 2010, Agrawal y sus colegas propusieron definir un secreto como "un grupo global de proteínas secretadas en el espacio extracelular por una célula, tejido, órgano u organismo en un momento arbitrario y bajo condiciones arbitrarias a través de mecanismos secretores conocidos y desconocidos, incluyendo orgánulos secretores no regulados y regulados » [5] .
Texto original (inglés)[ mostrarocultar] Proponemos una definición revisada del secretoma como "el grupo global de proteínas secretadas en el ECS por una célula, tejido, órgano u organismo en un momento y condiciones determinados a través de mecanismos secretores conocidos y desconocidos que involucran orgánulos secretores constitutivos y regulados".Las impurezas siempre están presentes en el cultivo celular . El suero bovino del medio de cultivo y los restos celulares contaminan un conjunto de proteínas secretadas que se utilizan para el análisis. Los componentes contaminantes del suero bovino son motivo de especial preocupación, ya que muchos de ellos tienen secuencias de proteínas similares a las humanas (p. ej., fibronectina y fibulina-1 ) [1] . Para eliminar los contaminantes, las células deben lavarse con tampón de fosfato de sodio (PBS) o medio sin suero (SFM) antes de la incubación en SFM y la recolección de proteínas secretadas. Todas las manipulaciones para la liberación de proteínas intracelulares deben realizarse con cuidado para evitar el daño celular [1] . Además, el tiempo y las condiciones de incubación pueden optimizarse para que el estrés metabólico causado por la falta de nutrientes en el medio de cultivo no afecte el análisis del secretoma [6] .
Algunas proteínas se producen en bajas concentraciones y luego se diluyen en medios de cultivo o fluidos corporales. Estas proteínas son difíciles de detectar. Las técnicas para detectar pequeñas cantidades, como la precipitación de proteínas con ácido tricloroacético , pueden usarse junto con métodos altamente sensibles, como el uso de micromatrices de anticuerpos , que pueden detectar incluso moléculas de proteína individuales [7] .
Muchos estudios del secretoma se realizan in vitro utilizando técnicas de cultivo celular. Pero no está claro si las mismas proteínas se secretan en condiciones in vivo . Un número creciente de estudios, especialmente aquellos que analizan secretomas tumorales, están utilizando métodos in vivo para confirmar la consistencia de los resultados obtenidos en el laboratorio. Por ejemplo, los fluidos corporales proximales cerca del tumor se recolectan para el análisis del secretoma [1] .
Muchas proteínas secretadas tienen una secuencia peptídica N-terminal que es responsable de la translocación de la proteína traducida al retículo endoplásmico (RE) . El procesamiento de proteínas tiene lugar en el RE , lo que eventualmente conducirá a la secreción. La presencia de estos péptidos señal se puede utilizar para predecir el secretoma de la célula. Los programas como SignalP pueden identificar secuencias de señales (y sus sitios de hidrólisis) para predecir las proteínas que se secretarán. Dado que las proteínas transmembrana también se procesan en el ER pero no se secretan, se utilizan programas como el servidor TMHMM para predecir los dominios transmembrana y así eliminar los falsos positivos . Algunas proteínas secretadas no tienen secuencias clásicas de péptidos señal. SignalP no detectará estas proteínas que carecen de un líder secretor N-terminal. SecretomeP es un programa que ha sido diseñado específicamente para intentar predecir proteínas secretoras no clásicas a partir de sus secuencias [5] . Se han predicho secretomas de todo el genoma para una amplia gama de organismos, incluidos humanos , ratones , peces cebra y cientos de bacterias [5] .
Los métodos de predicción del genoma completo tienen muchos problemas. Existe una alta probabilidad de resultados falsos positivos y falsos negativos. Además, la expresión génica depende en gran medida de las condiciones ambientales, lo que significa que es poco probable que el secretoma predicho a partir de bibliotecas genómicas o de ADNc coincida completamente con el verdadero secretoma. Para confirmar los datos así obtenidos, se necesitan enfoques proteómicos [5] .
Varias bases de conocimientos y secretomas de todo el genoma están disponibles en función de la curación y las predicciones informáticas. Estas bases de datos incluyen: la base de datos del secretoma fúngico (FSD), la base de conocimientos del secretoma fúngico (FunSecKB), la base de conocimientos del secretoma fúngico y el proteoma intracelular (FunSecKB2), la base de conocimientos del secretoma vegetal y el proteoma intracelular ( PlantSecKB ) y las bacterias del ácido láctico Base de datos del secretoma . La base de datos de proteoma intracelular y secretoma de metazoos (MetazSecKB) y la base de datos de proteoma intracelular y secretoma de protistas (ProtSecKB) se han lanzado recientemente . Aunque hay algunas imprecisiones en las predicciones por computadora, estas bases de datos proporcionan recursos útiles para caracterizar aún más la ubicación de las proteínas dentro de una célula.
El análisis espectrométrico de masas es una parte integral de la secretomica. El suero o sobrenadante que contiene las proteínas secretadas es digerido por una proteasa y las proteínas son separadas por electroforesis en gel bidimensional o técnicas de cromatografía . Luego, cada proteína individual se analiza mediante espectrometría de masas y el espectro de masas del péptido resultante se puede ver en una base de datos para identificar la proteína [1] .
El uso del método de etiquetado de isótopos no radiactivos basado en aminoácidos (SILAC) en cultivos celulares puede ayudar a distinguir entre la proteína secretada y las impurezas del suero bovino en cultivos celulares. El sobrenadante de las células cultivadas en medios normales y las células de los medios marcados con aminoácidos se mezclan en una proporción de uno a uno y luego se analizan mediante espectrometría de masas . Los contaminantes de proteína en el suero mostrarán solo un pico ya que no tienen un equivalente etiquetado [1] . Un ejemplo es el uso exitoso de SILAC para distinguir entre proteínas secretadas por condrocitos humanos e impurezas del suero [8] .
Recientemente, el uso de micromatrices de anticuerpos, un método de detección de proteínas extremadamente sensible y de alto rendimiento, se ha convertido en parte del análisis del secretoma. Los anticuerpos u otras moléculas aglutinantes se fijan a un soporte sólido. Después de eso, se agrega una mezcla de proteína marcada con fluorescencia . La intensidad de la señal se utiliza para identificar proteínas. Los microarrays de anticuerpos son extremadamente versátiles: se pueden utilizar para analizar la cantidad de proteína en una mezcla, analizar otras isoformas de proteínas , modificaciones postraduccionales y analizar la actividad bioquímica de las proteínas. Además, estos microarrays son muy sensibles: pueden detectar moléculas de proteína individuales. Actualmente, los microarrays de anticuerpos se usan más para el análisis de muestras de plasma humano , pero también se pueden usar para células cultivadas y análisis de secretomas de fluidos biológicos , lo que proporciona una forma sencilla de detectar simultáneamente múltiples proteínas [7] .
Además de su importante papel en los procesos fisiológicos normales, las proteínas secretadas también juegan un papel importante en la carcinogénesis , estando involucradas en el crecimiento celular, la migración y la invasión, y la angiogénesis . Estos aspectos hacen de la sectomía un excelente método para detectar biomarcadores de cáncer [9] . El uso del método proteómico para detectar biomarcadores de cáncer en fluidos biológicos o suero puede complicarse enormemente por el hecho de que los fluidos corporales son muy complejos y heterogéneos. El análisis del secretoma de líneas de células cancerosas en tejidos enfermos representa una alternativa más simple y precisa para la detección de biomarcadores [6] .
Para el análisis del secretoma del cáncer, se utilizan dos tipos principales de materiales: sobrenadantes de líneas de células cancerosas y fluidos biológicos (líquidos proximales y en contacto con el tumor ). El sobrenadante de las líneas de células cancerosas es la fuente preferida de proteínas secretadas. Hay muchas líneas cultivadas disponibles y es más fácil analizar el sobrenadante que el líquido corporal proximal. Pero no está claro si el secreto de la línea celular es una buena representación del tumor real en su microambiente específico. Además, las líneas celulares cultivadas no muestran la heterogeneidad de un tumor real [9] . El análisis de líquido proximal puede proporcionar una mejor comprensión del secretoma tumoral de una persona, pero este método también tiene sus inconvenientes. Los procedimientos de recolección de líquido proximal deben estandarizarse y se necesitan controles benignos. Además, las diferencias genéticas y adquiridas entre los pacientes pueden complicar el análisis [9] .
El análisis del secretoma ha revelado nuevos biomarcadores potenciales para muchos tipos de cáncer, incluidos el cáncer de pulmón , el cáncer de hígado , el cáncer de páncreas , el cáncer colorrectal , el cáncer de próstata y el cáncer de mama . El antígeno prostático específico (PSA) , el biomarcador estándar actual para el cáncer de próstata , tiene una especificidad diagnóstica baja: los niveles de PSA no siempre se distinguen entre cánceres malignos y benignos, por lo que se necesita un biomarcador más específico. El uso del análisis del secretoma de las líneas celulares de la próstata en un estudio reveló varias proteínas presentes en mayores cantidades en el suero de pacientes con cáncer que en personas sanas [6] .
También existe una gran necesidad de biomarcadores para detectar el cáncer de mama: en la actualidad, solo existen biomarcadores para el seguimiento de los estadios avanzados de este tipo de cáncer [2] . El análisis del secretoma de líneas celulares de cáncer de mama condujo al descubrimiento de la proteína activadora de la adhesión de células leucocitarias (ALCAM) , un nuevo biomarcador con potencial diagnóstico prometedor [6] .
El análisis de secretomas embrionarios humanos puede ser útil en la búsqueda de métodos no invasivos para determinar la viabilidad de los embriones . La FIV evalúa según criterios morfológicos para encontrar embriones con un alto potencial de implantación . La búsqueda utilizando un método cuantitativo de evaluación puede ayudar a reducir la cantidad de embriones utilizados en la FIV, lo que reduce la probabilidad de embarazo múltiple . Por ejemplo, en un estudio, obtenga huellas dactilares secretas para muchos blastocistos y encuentre 9 proteínas que pueden diferir entre blastocistos con números de cromosomas normales y anormales . Este método reemplazará el diagnóstico genético preimplantacional (DGP) , que involucra la biopsia de células embrionarias y puede ser perjudicial para el desarrollo del feto [10] .