La amplificación dependiente de helicasa ( en inglés Helicase-dependent amplificatio, HDA ), también amplificación isotérmica dependiente de helicasa , es un método de amplificación de ADN in vitro (similar a la reacción en cadena de la polimerasa ), que se lleva a cabo a una temperatura constante.
La reacción en cadena de la polimerasa es la técnica de amplificación de ADN in vitro más utilizada con fines de biología molecular e investigación biomédica [1] . Este proceso implica la separación del ADN de doble cadena a alta temperatura en una sola cadena ( paso de desnaturalización , generalmente logrado a 95-97 °C), la hibridación de los cebadores en el ADN de una sola cadena (paso de hibridación) y la copia del ADN de una sola cadena para crear nuevo ADN de doble cadena (paso de elongación, que requiere ADN polimerasa), que requiere que la reacción se lleve a cabo en un termociclador . Estas máquinas de sobremesa son grandes, costosas y requieren altos costos de operación y mantenimiento, lo que limita la aplicación potencial de la amplificación de ADN en situaciones fuera del laboratorio (p. ej., identificación de microorganismos potencialmente peligrosos en el lugar de una investigación o atención al paciente). Aunque la PCR se asocia comúnmente con los ciclos térmicos, el estudio original de Mullis et al. se describe el uso de helicasa como un medio para desnaturalizar el ADN de doble cadena, que incluye la amplificación isotérmica de ácidos nucleicos . En condiciones naturales, el ADN es replicado por ADN polimerasas con varias proteínas accesorias, incluidas las ADN helicasas, que actúan para separar el ADN desenrollando la doble hélice del ADN [2] . HDA se desarrolló a partir de este concepto, utilizando helicasa (una enzima) para desnaturalizar el ADN.
Las cadenas de ADN de doble cadena se separan primero mediante la ADN helicasa y se recubren con proteínas de unión a ADN de cadena sencilla (ssDNA). En el segundo paso, se hibridan dos cebadores específicos de secuencia con cada borde de la plantilla de ADN. Luego, las polimerasas de ADN se usan para extender los cebadores recocidos en las plantillas para producir ADN de doble cadena, y las helicasas de ADN usan los dos productos de ADN recién sintetizados como sustratos para ingresar a la siguiente ronda de la reacción. Por lo tanto, se desarrolla una reacción en cadena simultánea que conduce a la amplificación exponencial de la secuencia objetivo elegida (ver Vincent et al. , 2004 [3] para un esquema ).
Desde la publicación de su descubrimiento, la tecnología HDA se ha utilizado para "una prueba de ácido nucleico simple y altamente adaptable para detectar Clostridium difficile" [4] . Otras aplicaciones incluyen la detección rápida de Staphylococcus aureus por amplificación y detección de una secuencia corta de ADN específica de esta bacteria. La ventaja de HDA es que proporciona un método rápido para amplificar un ácido nucleico objetivo específico a temperatura isotérmica sin requerir el uso de un termociclador. Sin embargo, el investigador requiere una optimización previa de los cebadores y, en ocasiones, de los tampones. Por lo general, la PCR verifica y logra la optimización de los cebadores y los tampones, lo que plantea la cuestión de la necesidad de costos adicionales para un sistema separado para la amplificación real. Aunque HDA no requiere el uso de un termociclador y, por lo tanto, permite la investigación de campo, la mayor parte del trabajo requerido para identificar microorganismos potencialmente dañinos se realiza en laboratorios de investigación/hospitalarios. En la actualidad, aún no se pueden lograr diagnósticos masivos en una gran cantidad de muestras con HDA, mientras que las reacciones de PCR realizadas en un termociclador que acomoda placas de muestra de múltiples pocillos permiten la amplificación y detección del objetivo de ADN objetivo de hasta 96 muestras. Los reactivos de HDA también son relativamente más caros que los reactivos de PCR, especialmente porque vienen como un kit.