La inmuno-PCR [1] ( eng. inmuno-PCR ) es un método supersensible para detectar antígenos en función de su interacción específica con anticuerpos y la detección de esta interacción mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). En muchos sentidos, el método de inmuno-PCR es similar al ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), pero en lugar de una enzima para detectar el complejo antígeno-anticuerpo, utiliza un fragmento de ADN , cuya cantidad aumenta exponencialmente durante la PCR. La amplificación de este fragmento de ADN en la mezcla de reacción es la señal analítica del método [2] .
El método inmuno-PCR fue propuesto en 1992. Luego, los científicos de la Universidad de California lo usaron para detectar la albúmina sérica bovina (BSA). En su experimento, el límite de detección fue cinco órdenes de magnitud mayor que el de ELISA estándar, a 580 moléculas por muestra [2] [3] .
El método inmuno-PCR es una combinación de ELISA y PCR . El primero de ellos se utiliza si es necesario detectar hormonas , anticuerpos , proteínas o toxinas en el diagnóstico clínico . Debido a la disponibilidad de anticuerpos de diversas especificidades, este método permite la detección de una amplia gama de antígenos . Sin embargo, la sensibilidad de ELISA es relativamente baja. Por otro lado, el método PCR ampliamente utilizado sirve para detectar cantidades muy pequeñas de ADN. Teóricamente, incluso una copia del ADN detectable en la muestra de prueba es suficiente para diagnosticar enfermedades virales y bacterianas o enfermedades hereditarias. La idea de la inmuno-PCR es detectar varios antígenos con anticuerpos específicos, pero recibir una señal positiva sobre esta detección no con la ayuda de una enzima, como en ELISA, sino con la ayuda de una etiqueta de ADN, como en RCP [4] .
En la primera etapa de la inmuno-PCR, se lleva a cabo una reacción inmunoquímica entre el compuesto analizado en la muestra y el anticuerpo. Por analogía con ELISA, se implementa de varias maneras. En la versión directa (Fig. 1, A), se aplica sobre la superficie de la placa una muestra que contiene el antígeno a determinar y luego se determina directamente el antígeno con un anticuerpo específico marcado con ADN. Si no se dispone de un anticuerpo específico marcado con ADN, se determina mediante un anticuerpo secundario (antiespecie) unido a ADN. Tal formato se llama indirecto (Fig. 1, B). Para determinar el antígeno en matrices ( suero sanguíneo , plasma ), se utiliza un "sándwich" (Fig. 1, C). Para ello, los anticuerpos de unión se inmovilizan preliminarmente en la superficie de la tableta, que se unen al antígeno cuando la muestra se aplica al pocillo. También es posible una versión indirecta del sándwich (Fig. 2, D) [5] [6] .
Para la determinación de sustancias de bajo peso molecular se utiliza un formato competitivo. En este caso, el anticuerpo marcado de detección interactúa no solo con el antígeno en la muestra analizada, sino también con el antígeno inmovilizado en la fase sólida. Cuanto más antígeno hay en la muestra, más complejos antígeno-anticuerpo se forman en la solución. En consecuencia, menos anticuerpos se unen a la fase sólida y el ensayo da una señal más baja [5] .
En algunos casos, en lugar de anticuerpos, se pueden usar aptámeros para detectar antígenos . Por ejemplo, el aptámero de ARN R18 se une específicamente a IgG de conejo . Esta modificación se denomina PCR inmunoaptamérica [7] .
En la segunda etapa, cuando el antígeno se une al conjugado del anticuerpo y la etiqueta de ADN, se lleva a cabo una reacción en cadena de la polimerasa, como resultado de lo cual la cantidad de ADN en la mezcla aumenta exponencialmente. En los primeros experimentos, los productos de amplificación se analizaban por electroforesis en gel de agarosa, pero para ello era necesario transferir las mezclas de reacción al gel, y los resultados eran cualitativos o semicuantitativos. Como alternativa a la electroforesis, se propuso la PCR en tiempo real (RT-PCR): este método le permite establecer no solo la presencia de una etiqueta de ADN, sino también su cantidad. Cuando se realiza una PCR en tiempo real, se agrega a la mezcla un tinte intercalado (por ejemplo, SYBR Green I ) o una sonda TaqMan , y la cantidad de ADN se determina por la intensidad de la fluorescencia . La etapa de amplificación se puede realizar en el mismo tubo que la reacción inmunoquímica o se puede transferir el marcador de ADN a otro tubo. En el segundo caso, primero se debe escindir con la ayuda de restrictasas o calentando a 95-100 ° C. Al mismo tiempo, se observa que el análisis en un tubo de ensayo es significativamente menos sensible [7] [8] .
Teóricamente, para obtener una señal positiva, es suficiente que una copia de la marca de ADN esté presente en la mezcla de reacción. De hecho, la sensibilidad del método se reduce debido a las etapas basadas en la interacción del antígeno con el anticuerpo. Creo que el límite de detección de los métodos inmunoquímicos en general es de unas 1000 moléculas de analito en 100 μl de la mezcla. Las técnicas de inmuno-PCR descritas en muchas publicaciones muestran una sensibilidad cercana a este límite de detección e incluso inferior. Si suponemos que una proteína típica pesa entre 50 y 100 kDa, el recálculo del límite de detección de la inmuno-PCR dará una masa del orden de un picogramo del analito. Esta sensibilidad es suficiente para detectar muchos biomarcadores presentes en el cuerpo en bajas concentraciones [9] .
La plataforma de análisis, como en el caso de ELISA o PCR, es una placa de microtitulación de 96 pocillos , que debe ser capaz de unir antígenos y ser termorresistente para poder realizar la PCR directamente en ella sin traspasar la mezcla de reacción a otro plato También son comunes las tiras de 8 pocillos de policarbonato TopYield con mayor capacidad de unión, diseñadas específicamente para inmuno-PCR. (Aunque existen desventajas asociadas con la forma de sus pocillos: distribución desigual del calor durante la PCR y la aparición de zonas de refracción y reflexión de la luz, lo que dificulta el análisis de las curvas de PCR). La inmuno-PCR también se realiza en Corning Costar. placas de policarbonato 6511 y placa de policarbonato Greiner Thermoquick 651570, así como en tabletas Robostrips [10] .
Un anticuerpo marcado con un fragmento de ADN es un elemento clave en la realización de inmuno-PCR. La sensibilidad y reproducibilidad del método dependen de la estructura de este conjugado. Según la naturaleza de la relación entre el anticuerpo y el ADN, se distinguen tres tipos principales de tales conjugados: proteínas quiméricas, conjugados biotina-estreptavidina y conjugados covalentes [11] .
Inicialmente, se utilizó una proteína quimérica especial en inmuno-PCR, que incluía un fragmento de proteína A y un fragmento de estreptavidina . Un fragmento de proteína A se unió al anticuerpo y la estreptavidina se unió al ADN con una modificación de biotina (Fig. 2a). Este conjugado tiene dos inconvenientes. En primer lugar, la síntesis de proteínas quiméricas requiere mucho tiempo en sí misma. En segundo lugar, la proteína A no solo tiene afinidad por el anticuerpo especificado, sino que también interactúa de forma no específica con los anticuerpos de unión que se utilizan al establecer la inmuno-PCR en formato "sándwich". Debido a esto, aparece una señal de fondo y la sensibilidad del método disminuye [2] [4] .
Resultó ser más simple en la práctica crear un conjugado basado en la interacción de biotina y estreptavidina (Fig. 2, B) [12] . Se sabe que las proteínas tetraméricas avidina (natural) y estreptavidina ( modificada genéticamente a partir del cultivo de Streptomyces avidii ) forman un complejo muy estable con la biotina ( constante de disociación 10–13–10–15 ) . La biotina se introduce químicamente en las moléculas conjugadas: anticuerpo y ADN, y luego estas moléculas se mezclan con estreptavidina (es más preferible porque, a diferencia de la avidina, no contiene fragmentos de carbohidratos que den lugar a interacciones no específicas) para formar un conjugado [2] [ 13] .
Este enfoque no es del todo óptimo, porque debido a la tetravalencia de la avidina o la estreptavidina, los conjugados resultantes pueden tener una composición variable, lo que afectará la reproducibilidad del experimento [14] . Sin embargo, estudios posteriores del autoensamblaje de dichos complejos demostraron que la estreptavidina, a pesar de su naturaleza tetravalente, tiende a unirse predominantemente a dos moléculas de ADN biotiniladas, y no se forman conjugados con cuatro moléculas de ADN en absoluto [15] . La disponibilidad comercial de los reactivos necesarios ha convertido este enfoque en un "protocolo universal de inmuno-PCR" [16] , que se ha vuelto muy popular [17] .
Gracias al desarrollo de métodos de bioconjugación , se hizo posible sintetizar químicamente conjugados covalentes de anticuerpos con ADN usando reticuladores bifuncionales (Fig. 2, C). Numerosos reactivos están disponibles en el mercado para este propósito. Por regla general, la conjugación se lleva a cabo mediante modificación química de grupos amino o grupos tiol de ADN o anticuerpos. También se están desarrollando enfoques relacionados con las reacciones químicas del clic . Por otro lado, la literatura científica presenta datos insuficientes o contradictorios sobre el rendimiento de tales conjugados y métodos para su purificación [2] [18] .
Dado que en los conjugados covalentes el anticuerpo de detección y la etiqueta de ADN están unidos de forma única (mientras que en los conjugados de biotina-estreptavidina son complejos de equilibrio), esto hace posible determinar varios antígenos en una muestra. Uno de los primeros análisis de este tipo se llevó a cabo para tres analitos utilizando etiquetas de ADN de diferentes longitudes [19] . Al determinar la interleucina 6 , se compararon diferentes enfoques y se demostró que el uso de conjugados covalentes conduce a un aumento de 100 veces en la sensibilidad en comparación con un protocolo gradual [20] .
Las principales etapas en el desarrollo de inmuno-PCR: [21]
Se logró aumentar la sensibilidad de la inmuno-PCR utilizando el “doble reconocimiento” del antígeno. El método de ligadura de sonda proximal se basa en el uso de dos anticuerpos específicos para dos epítopos adyacentes del antígeno que se está determinando. Las etiquetas de ADN de estos anticuerpos difieren en la secuencia de nucleótidos pero tienen pequeñas regiones complementarias. Cuando ambos anticuerpos interactúan con un antígeno, sus marcas de ADN se acercan en el espacio y luego se unen bajo la acción de la enzima ligasa . Esto crea una nueva hebra de ADN, que se amplifica. Dado que una señal positiva solo es posible si el antígeno es reconocido por dos anticuerpos a la vez, este esquema permite excluir la unión no específica [22] .
Las posibilidades de la inmuno-PCR se amplían debido al uso de varias nanoestructuras en el análisis. Por ejemplo, se ha propuesto utilizar nanopartículas magnéticas o de oro como portador de anticuerpos . Su uso facilita la realización de las manipulaciones necesarias y reduce la influencia de componentes extraños de la muestra. Ambas nanopartículas se utilizan en el ensayo de biocódigo de barras : las nanopartículas magnéticas contienen anticuerpos de unión, mientras que las nanopartículas de oro contienen anticuerpos de detección y una etiqueta de ADN. El análisis se lleva a cabo en formato sándwich, después de lo cual los inmunocomplejos se recolectan con un imán y el ADN se escinde de nanopartículas de oro para su posterior análisis. El nombre "biobarcoding" se debe al hecho de que la publicación original proponía un método de análisis escanométrico. Así, el ADN escindido se conjugó sobre una superficie de vidrio, sobre la que se fijaron previamente los oligonucleótidos complementarios a la mitad de la cadena de ADN. Luego se agregaron nanopartículas de oro recubiertas con plata (I) y que contenían oligonucleótidos complementarios a la segunda mitad de la etiqueta de ADN. Entonces la plata fue restaurada. Si había una etiqueta de ADN ("código de barras") en el sistema, el sistema daba una señal positiva. Las perspectivas de este método están asociadas a la posibilidad de determinación simultánea de varios analitos, ya que las nanopartículas pueden ser "codificadas" por oligonucleótidos con una secuencia de oligonucleótidos única [23] [24] .
Un desarrollo interesante del método es el uso de los llamados "renacuajos" ( ing. tadpoles ). Estos son conjugados especiales en los que la "cabeza" de la proteína se une a la cola del ADN. La parte proteica de dichos conjugados contiene una etiqueta de histidina que reconoce el antígeno objetivo, la inteína y un dominio de unión a quitina . La proteína se purificó en columnas que contenían quitina, la inteína se escindió en estado inmovilizado y se le adjuntó un oligonucleótido que contenía un residuo de cisteína [25] [26] .
También existen sistemas de inmuno-PCR que utilizan partículas virales, liposomas y visualización de fagos [27] .
En 2010 , se propuso utilizar conjugados basados en bloqueo Tus-Ter . Tus es una proteína que detiene el proceso de replicación; se une fuertemente a secuencias cortas de nucleótidos Ter. El complejo Tus-Ter se usó para la unión estequiométrica y específica del sitio de una etiqueta de ADN y un anticuerpo [28] .
A partir de 2015, el método inmuno-PCR se ha comercializado: los servicios para la creación de sistemas analíticos, incluidos los que cumplen con las normas GLP , son proporcionados por organizaciones de investigación por contrato y servicios bioanalíticos [29] .
Varios grupos de investigación han aplicado el método de inmuno-PCR para detectar proteínas importantes y compuestos de moléculas pequeñas. Al mismo tiempo, muchos de estos experimentos se utilizaron para estudiar las posibilidades del método en sí mismo, comparar diferentes formatos y tipos de conjugados y determinar los límites de sensibilidad. Los datos de estos estudios están sistematizados en revisiones [30] [31] y, a continuación, se encuentran los principales resultados sobre las clases de analitos detectados.
Los antígenos más comunes para inmuno-PCR son proteínas marcadoras relacionadas con tumores y presentes en las primeras etapas de su desarrollo en concentraciones muy bajas. Los más importantes entre ellos son el antígeno embrionario del cáncer (CEA) y el antígeno prostático específico (PSA). En un estudio, se encontró que el método inmuno-PCR era aproximadamente 1000 veces más sensible a CEA que ELISA [32] , y luego la sensibilidad a CEA se incrementó a 13 fg/ml, que es 1500 veces más alta que la sensibilidad de la prueba clínica. métodos [33] .
El PSA sirvió como analito para probar tres formatos de inmuno-PCR, de los cuales el más sensible fue el formato que usaba un conjugado de ADN-anticuerpo covalente (el límite de detección era de 48·10 5 moléculas) [34] . Un sistema basado en nanopartículas magnéticas permitió determinar PSA 0,1 pM, que es 1000 veces más sensible que ELISA [35] .
La inmuno-PCR se usa para determinar las proteínas virales, ya que en las primeras etapas hay una cantidad muy pequeña de viriones en el cuerpo , y solo pueden determinarse mediante métodos altamente sensibles. Uno de los antígenos populares de este tipo es el marcador del virus de la hepatitis B HBsAg : el trabajo de varios grupos ha reducido el límite de detección de este antígeno por inmuno-PCR a 15 fg por reacción, y la ventaja en sensibilidad sobre ELISA fue 2000 veces [ 36] . Además, la inmuno-PCR puede detectar 10 ng de HBcAg , otra proteína asociada con la presencia del virus de la hepatitis B en el organismo [37] .
El antígeno p24 es un componente de la cápside del virus VIH-1 y ayuda a identificar este virus en una etapa temprana. Con la ayuda de inmuno-PCR en diferentes experimentos, fue posible detectar 1000 y 4600 moléculas de este antígeno [38] . El virus Hantaan generalmente se detecta mediante métodos de inmunoensayo de proteínas de la nucleocápside. La inmuno-PCR mediante phage display permitió detectar 10 pg/ml de esta proteína, y al utilizar nanopartículas de oro, la sensibilidad aumentó a 10 fg/ml, que es siete órdenes de magnitud mejor que en el caso de ELISA [39] . En los ensayos para el virus de la influenza aviar H5N1 , la inmuno-PCR también es superior a ELISA y PCR en tiempo real por 1000 y 100 veces, respectivamente [40] [41] .
Los adenovirus también se determinan mediante inmuno-PCR , y este método tiene una ventaja sobre la PCR, ya que para la PCR es necesario aislar el ADN de la muestra, y en el método de inmuno-PCR, la purificación de componentes extraños ocurre en las etapas de lavado. La sensibilidad de la inmuno-PCR a rotavirus , según datos de la literatura, coincide con la sensibilidad de la PCR. Además, el método de inmuno-PCR es útil para la detección de norovirus [42] .
La inmuno-PCR también se usa para detectar patógenos. Por ejemplo, Staphylococcus aureus puede identificarse por sus muchas enzimas, proteínas y toxinas, en particular la proteína A y la enterotoxina tipo B. El primero de ellos fue determinado por inmuno-PCR a una concentración de 1· 10-17 g/mL, y para el segundo se desarrollaron sistemas que permiten determinarlo tanto en cultivos puros como en muestras de alimentos [43] [44 ] . Se ha descrito un método para detectar la bacteria Borrelia burgdorferi , el agente causante de la enfermedad de Lyme , mediante anticuerpos IgG e IgM específicos contra esta bacteria [45] [46] .
También se describen ejemplos de determinación de bacterias, plantas y micotoxinas . Por ejemplo, la toxina botulínica en agua desionizada se detectó a una concentración de aproximadamente 12 moléculas/ml (0,02 fg/ml). En otro experimento, se determinó el toxoide A a una concentración de 90 pg/ml. También se determinaron toxinas en la leche (3,75 pg/ml para toxina botulínica tipo A, 750 pg/ml para toxoide botulínica tipo B, 0,1 pg/ml para toxina Shiga tipo 2). La ricina se ha encontrado en alimentos en una concentración de 10-100 pg/ml. También se han publicado datos sobre la determinación de aflatoxinas y bifenilos policlorados [47] .
El diagnóstico de algunas enfermedades y trastornos se basa en la detección no de antígenos externos, sino de los componentes del propio organismo, como enzimas , compuestos de bajo peso molecular e iones. En algunos casos, el método inmuno-PCR es aplicable para estos fines. Así, el factor de necrosis tumoral se encontró en concentraciones de hasta 1 fg/ml (50.000 veces más sensible que ELISA). La fosfatasa alcalina se detectó con un anticuerpo IgG específico en una cantidad de 10–11 U [48] .
Algunos antígenos están asociados con el desarrollo de trastornos genéticos y enfermedades del sistema nervioso. La alta sensibilidad de la inmuno-PCR permite detectar concentraciones muy bajas de priones en muestras de tejido cerebral y líquido cefalorraquídeo difíciles de obtener . Se ha propuesto una técnica que permite determinar simultáneamente tres proteínas principales asociadas al sistema nervioso mediante inmuno-PCR: prión, enolasa específica de neurona y proteína ácida fibrilar glial [48] .
Marcadores importantes de trastornos del sistema nervioso son las proteínas tau : las proteínas tau defectuosas ( fosforiladas en epítopos o isoformas de estas proteínas) estabilizan mal los microtúbulos , lo que provoca patologías. La inmuno-PCR permite la detección de isoformas defectuosas de proteínas tau a una concentración de 2-10 pg/ml. El beta-amiloide , uno de los iniciadores de la enfermedad de Alzheimer, se detectó a una concentración de 2 amol/l [48] .
La enfermedad de Fabry está asociada con defectos en el gen de la alfa-galactosidasa A. Por lo general, esta proteína se determina mediante ELISA, pero la inmuno-PCR proporciona un aumento de sensibilidad de 25 veces [49] .
El método de inmuno-PCR es muy sensible, por lo que la señal de fondo juega un papel fundamental en él, lo que puede interferir con la observación de un resultado positivo. La razón de esto es la unión no específica de los componentes de la mezcla de reacción o la presencia de trazas de ADN libre en el conjugado anticuerpo-ADN. Los ADN individuales aparecen incluso en muestras de control negativo, y su presencia casi siempre aparece en el ciclo de PCR 30-40. La optimización de la inmuno-PCR (selección de soluciones de lavado, aumento de la duración del lavado, uso de nucleasas ) permite lograr la máxima diferencia entre la señal de fondo y la señal en los tubos de ensayo con la presencia del antígeno que se determina. La sensibilidad de la inmuno-PCR tiene otro inconveniente: la calidad de la determinación se deteriora debido a la posibilidad de contaminación cruzada de las mezclas de reacción o contaminación del medio ambiente. Para evitar esto, el sitio del trabajo inmunoquímico y el sitio de la PCR están separados en el espacio [50] [51] .
La inmuno-PCR es un método que requiere mucha mano de obra: el análisis implica alrededor de 20 pasos de lavado y el análisis total dura de 26 horas a 2 días. El tiempo de análisis se puede reducir mediante la preparación previa de conjugados de anticuerpo y ADN. De lo contrario, deben prepararse durante el análisis; mientras que aumenta el número de etapas de incubación y lavado [52] .