La clonación de ADN (clonación de genes) es el proceso de aislar una secuencia de ADN dada y obtener muchas copias de ella in vitro . La clonación de ADN se utiliza a menudo para amplificar fragmentos que contienen genes , así como cualquier otra secuencia, como promotores , secuencias no codificantes , oligonucleótidos sintetizados químicamente y secciones aleatorias de ADN.
En las técnicas clásicas de restricción y ligadura, la clonación de un fragmento de ADN incluye cuatro pasos: cortar el ADN con endonucleasas de restricción , ligar el ADN con un vector , transfección y posterior cribado (selección).
Inicialmente, es necesario aislar un trozo de ADN para la clonación. A menudo, una preparación de ADN para la clonación se obtiene usando una reacción en cadena de la polimerasa , así como cortando el ADN con enzimas de restricción , sonicando el ADN y fraccionando usando electroforesis de ADN en agarosa . El aislamiento del inserto se puede realizar mediante tecnología de clonación de escopeta, ADN complementario , síntesis química artificial.
Después de la ligadura con el plásmido, las bacterias se transforman para crecer. A continuación, las bacterias se cultivan en un medio selectivo para seleccionar las colonias que contienen el inserto. Se seleccionan colonias individuales y se examinan para detectar la presencia de inserción.
Después de la ligadura, la mezcla de reacción con el vector insertado en la orientación requerida se coloca en las células. Según el tipo de célula, se utilizan la sensibilización celular química, la electroporación o las pistolas de genes . La sensibilización química no requiere equipo especial. La electroporación se usa cuando se requiere una alta eficiencia de transfección. Las pistolas de genes se utilizan en el caso de células y tejidos vegetales, ya que la pared celular de la planta no permite que el ADN extraño penetre en el citoplasma y el núcleo.
Obtener el cultivo de células transfectadas. Dado que los procedimientos descritos anteriormente a menudo tienen una eficacia baja, se requieren métodos para identificar las células que contienen el inserto deseado en la orientación correcta y para separar dichas células de las que no contienen el inserto. Los vectores de clonación modernos contienen marcadores seleccionables (generalmente genes de resistencia a los antibióticos) que permiten que solo las células con el inserto correcto crezcan en el medio selectivo (con el antibiótico). Los vectores de clonación también suelen contener marcadores de color de colonias, por ejemplo, cuando se cultivan en un medio que contiene X-gal . La confirmación precisa de una clonación exitosa requiere verificación por reacción en cadena de la polimerasa (PCR), polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción (RFLP) o secuenciación de ADN .
La terapia génica implica la introducción de un gen funcional en células que no lo tienen, lo que conduce a una cura para la enfermedad asociada con la ausencia o mal funcionamiento del gen. La terapia génica se clasifica en dos categorías. En el primer caso, las mutaciones están contenidas en células madre o germinales , luego todo el organismo y todos los descendientes tienen un defecto. En el segundo caso, la mutación ocurre en células somáticas , es posible el trasplante de células o tejidos modificados. Los ensayos clínicos de terapia génica de células somáticas comenzaron a fines de la década de 1990 para tratar el cáncer de sangre, hígado y pulmón.