Microscopia confocal

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La microscopía confocal (microscopía de escaneo láser confocal, CLSM ( English  confocal laser scanning microscopy )) es un tipo de microscopía óptica de luz con un contraste y una resolución espacial significativos en comparación con la microscopía de luz clásica, que se logra utilizando un agujero de alfiler (pinhole) colocado en el plano de la imagen y limitando el flujo de luz dispersada de fondo emitida no desde el plano focal de la lente [1] . Esto permite obtener series de imágenes a diferentes profundidades del plano focal dentro de la muestra (el llamado corte óptico de la muestra en profundidad), y luego reconstruir una imagen tridimensional de la muestra a partir de estas series. La microscopía confocal se ha utilizado ampliamente en biología, medicina, ciencia de materiales y física de semiconductores.

Historia

Primeros prototipos

En 1940, Hans Goldmann, un oftalmólogo de Berna, Suiza, desarrolló un sistema de lámpara de hendidura para documentar los exámenes oculares [2] . Este sistema es considerado por algunos autores posteriores como el primer sistema óptico confocal. [3] [4]

En 1943, Zun Koana publicó el sistema confocal. [3] En 1951, Hiroto Naora, colega de Koana, describió el microscopio confocal en Science para espectrofotometría [5] .

En la década de 1950, los biólogos necesitaban aumentar el contraste de las imágenes de objetos marcados con fluorocromo en secciones gruesas de tejido [6] . Para solucionar este problema , Marvin Minsky , profesor del Instituto Tecnológico de Massachusetts en Estados Unidos, propuso utilizar un esquema confocal para microscopios de fluorescencia. En 1957, Minsky recibió una patente para este esquema [7] .

Microscopio de barrido en tándem

En la década de 1960, el científico checoslovaco Mojmir Petran, de la Facultad de Medicina de la Universidad Charles en Pilsen, desarrolló el microscopio de barrido en tándem, el primer microscopio confocal comercial que utilizaba un disco giratorio, el disco de Nipkow,  para crear y localizar múltiples fuentes puntuales de excitación. y radiación. [8] [9]

Petran y su colega Milan Hadravsky presentaron una patente checoslovaca en 1966. La primera publicación científica con datos e imágenes obtenidas mediante este microscopio, por David Egger de la Universidad de Yale y el propio Mojmir Petran, se publicó en la revista Science en 1967 [10] . Una segunda publicación en 1968 describe la teoría y los detalles técnicos del instrumento [11] . En 1970, la invención fue patentada en los Estados Unidos. [12]

Combinando un microscopio confocal con un iluminador láser

En 1969 y 1971 los científicos David Egger y Paul Davidovich de la Universidad de Yale publicaron artículos pioneros que describen el primer microscopio de barrido láser confocal [13] [14] Era un escáner puntual, es decir, solo se generaba un punto de iluminación. Usaron epi-iluminación en luz reflejada para observar el tejido neural. Se utilizó un láser de helio-neón de 5 mW con una longitud de onda de 633 nm como fuente de radiación coherente . El rayo láser fue reflejado por un espejo semitransparente en la dirección del objetivo . El objetivo era una lente simple con una distancia focal de 8,5 mm. A diferencia de todos los diseños anteriores (y posteriormente posteriores de sistemas confocales), la muestra se escaneaba mediante el movimiento de esta lente (escaneo objetivo), lo que conducía al movimiento del punto focal. La luz reflejada se devolvía a un espejo translúcido, enfocada por otra lente en un diafragma ( agujero de alfiler ), detrás del cual se colocaba un tubo fotomultiplicador . La señal se visualizó utilizando un osciloscopio CRT , el rayo catódico se movió simultáneamente con la lente. Con la ayuda de un adaptador especial, fue posible tomar fotos con una cámara Polaroid. Tres de las fotografías obtenidas de esta manera fueron publicadas en un artículo de 1971 [14] .

También se han desarrollado los esquemas del microscopio de barrido confocal de Marvin Minsky que utiliza radiación láser [15] . En el futuro, la principal atención de los investigadores se dirigió al análisis del uso de colorantes fluorescentes para estudios in vivo y la mejora de la calidad de las imágenes confocales mediante el aumento de la intensidad de la radiación fluorescente.

Desarrollo de sistemas de escaneo

En 1977, Colin J. R. Sheppard y Amargioti Chowdhury publicaron un análisis teórico de los microscopios de barrido confocal y láser. [16] Esta fue probablemente la primera publicación científica en utilizar el término "microscopio confocal". [17] En 1978, Christoph Kremer y Thomas Kremer publicaron un diseño para un microscopio de barrido láser confocal usando excitación fluorescente con enfoque automático electrónico. [18] Este modelo CLSM fue el primero en combinar el escaneo láser con la detección volumétrica de objetos biológicos etiquetados con marcadores fluorescentes. En 1978 y 1980, el grupo de Oxford de Colin Sheppard y Tony Wilson describió un sistema confocal con iluminación epi-láser, una platina de escaneo y fotomultiplicadores como detectores. La mesa podía moverse a lo largo del eje óptico, lo que permitía realizar cortes ópticos tridimensionales capa por capa [17] . En 1979, Fred Brackenhoff y sus colegas demostraron que los beneficios teóricos del seccionamiento óptico y la resolución óptica mejorada se podían lograr en la práctica. [19] En 1983, I. Cox y S. Sheppard publicaron el primer trabajo en el que un microscopio confocal era controlado por una computadora personal. [veinte]

Escaneo de puntos con un rayo láser

A mediados de la década de 1980, William Bradshaw Amos y John Gralham White y sus colegas del Laboratorio de Biología Molecular de Cambridge construyeron el primer microscopio confocal de barrido láser. [21] [22] En su esquema óptico, el escaneo se realizaba moviendo secuencialmente el haz de luz sobre la muestra, y no moviendo la mesa de muestras. Este esquema permitió aumentar significativamente la velocidad de escaneo debido al rechazo de los sistemas de escaneo mecánico inercial y lograr una velocidad de hasta cuatro cuadros por segundo (512 líneas en cada uno). [21]

Paralelamente, el Consejo de Investigación Médica (MRC) del Reino Unido patrocinó el desarrollo de un prototipo de microscopio confocal comercial moderno, que luego fue adquirido por Bio-Rad, controlado por computadora y comercializado como "MRC 500". El sucesor del MRC 600 más tarde se convirtió en la base para el desarrollo del primer microscopio de fluorescencia de dos fotones, desarrollado en 1990 en la Universidad de Cornell. [19]

La investigación realizada en la Universidad de Estocolmo casi al mismo tiempo también se transformó en el CLSM Sarastro comercial. [23]

La empresa fue adquirida en 1990 por Molecular Dynamics [24] , pero finalmente se abandonó el desarrollo posterior del sistema.

En 1989, Fritz Karl y Eckhard Praikschat inventaron el microscopio de diodo láser de barrido para el análisis del tamaño de partículas. [25] [26]

En Alemania, Heidelberg Instruments, fundada en 1984, desarrolló la tecnología CLSM, que originalmente estaba destinada a aplicaciones industriales, no biológicas. A principios de la década de 1990, esta tecnología fue desarrollada activamente por Leica Lasertechnik y Carl Zeiss , que en ese momento ya producían con éxito microscopios ópticos con un esquema de escaneo de rayo láser implementado, que luego se actualizaron a sistemas confocales [27] .

Cómo funciona

El esquema óptico de un microscopio de luz convencional forma una imagen de toda la parte de la muestra ubicada en la profundidad de campo del microobjetivo utilizado, y el microscopio confocal forma una imagen de una sección muy delgada del objeto al mismo nivel de profundidad. En esencia, el método CLSM se logra controlando la profundidad de enfoque del sistema óptico.

El principio de la imagen confocal fue patentado en 1957 por Marvin Minsky [28] [29] y pretende superar algunas de las limitaciones de los microscopios de fluorescencia tradicionales. En un microscopio fluorescente convencional (de campo amplio), la fuente de radiación del microscopio ilumina uniformemente toda la muestra. En este caso, toda la muestra se irradia y se excita simultáneamente, y la fluorescencia resultante se detecta mediante un fotodetector o una cámara microscópica, incluida una gran parte del fondo del objeto. Por el contrario, un microscopio confocal utiliza una luz puntual (ver Función de dispersión de puntos ) y un orificio en el plano óptico conjugado frente al detector para eliminar la señal fuera de foco. Por lo tanto, la radiación fluorescente se detecta solo desde el plano focal, por lo que la resolución óptica de la imagen, especialmente a lo largo del eje Z (a lo largo de la profundidad de la muestra), es mucho mayor que la de los microscopios ópticos convencionales. Sin embargo, dado que la mayor parte de la fluorescencia de la muestra está bloqueada, un aumento en la resolución va acompañado de una disminución en la intensidad de la señal útil. Para compensar este efecto secundario, se utiliza una exposición del detector más prolongada y fotodetectores de alta sensibilidad, generalmente un PMT o un fotodiodo de avalancha , que convierten la señal óptica en eléctrica, seguido de registro en una computadora personal [30] .

Dado que solo se registra un punto fluorescente en la muestra, se requiere un escaneo de trama de la muestra para formar una imagen 2D o 3D. El rayo láser se mueve a lo largo de la muestra en un plano horizontal usando uno o más espejos con un ángulo de inclinación controlado. Este método de escaneo suele tener una velocidad de escaneo baja, que, sin embargo, puede variar. Por ejemplo, un escaneo más lento proporciona una mejor relación señal-ruido, lo que da como resultado un mejor contraste y una resolución más alta.

Como es sabido, la profundidad de campo de CLSM es directamente proporcional a la longitud de onda de la radiación utilizada e inversamente proporcional a la apertura numérica del microobjetivo, y también depende de las propiedades ópticas de la muestra. Debido a esto, la reconstrucción de software de un punto de objetos 3D se lleva a cabo en CLSM con la ayuda de varios algoritmos. El más común es el algoritmo de búsqueda del máximo de intensidad. [31]

Un microscopio confocal tiene la misma resolución que un microscopio convencional y está limitado por el límite de difracción .

donde  es la longitud de onda de la radiación,  es la apertura numérica del objetivo,  es el índice de refracción del medio entre la muestra y el objetivo,  es la mitad del ángulo que “captura” el objetivo. En el rango visible, la resolución es de ~ 250 nm (NA=1,45, n=1,51).Sin embargo, en los últimos años se han desarrollado con éxito diseños de microscopios que aprovechan las propiedades no lineales de la fluorescencia de las muestras. En este caso, se logra una resolución que es mucho más pequeña que el límite de difracción y asciende a ~ 3–10 nm [32] [33] [34] [35] .

Consideremos ahora la cuestión de aumentar el contraste cuando se utiliza un esquema óptico confocal. En primer lugar, dado que la luz pasa dos veces a través de la lente en un microscopio confocal, la función de punto borroso (en lo sucesivo, PSF ) tiene la siguiente forma:

,

donde Pconf es la función de desenfoque de punto confocal y p es la función de desenfoque de punto regular.

Así, el espesor alcanzable del plano focal está determinado principalmente por la longitud de onda de la radiación utilizada dividida por la apertura numérica del objetivo, y también depende de las propiedades ópticas de la muestra. Debido a su delgada sección óptica, estos tipos de microscopios son particularmente buenos para la obtención de imágenes en 3D y el perfilado de superficies de muestras.

Los cortes secuenciales forman una "pila z" que puede ser procesada por cierto software para crear una imagen renderizada en 3D, o presentada en una pila 2D para su publicación, gracias a un algoritmo de búsqueda de intensidad máxima común. [31]

La microscopía confocal proporciona un corte óptico secuencial directo y no invasivo de especímenes vivos gruesos e intactos con requisitos mínimos de preparación, así como una resolución lateral más alta en comparación con la microscopía de luz convencional [36] [37] . Por lo general, las muestras biológicas se contrateñen con tintes fluorescentes para visualizar sus regiones u orgánulos específicos. Sin embargo, la concentración de colorante real se puede mantener muy baja para minimizar el impacto en los sistemas biológicos. Por lo tanto, algunos sistemas confocales pueden rastrear moléculas fluorescentes individuales [38] . Además, las tecnologías transgénicas pueden crear organismos que produzcan sus propias moléculas quiméricas fluorescentes (marcadas con GFP, proteína verde fluorescente) [39] .

Un microscopio de barrido láser confocal con alto contraste brinda dos oportunidades invaluables: le permite examinar tejidos a nivel celular en un estado de vitalidad fisiológica, así como evaluar los resultados (dinámica) de la actividad celular en cuatro dimensiones: alto, ancho, profundidad y tiempo. [40]

Resolución espacial en microscopía confocal

Aplicando el criterio de resolución de Rayleigh (dip 26% del máximo de distribución), encontramos que la resolución en el microscopio confocal aumenta, pero no significativamente. Para un microscopio confocal, la resolución (r c ) se define como sigue [8] [41] [1] :

,

donde n es el índice de refracción relativo, D es el diámetro de la pupila de entrada del sistema óptico, λ es la longitud de onda, F es la distancia focal del microobjetivo, θ es el ángulo de apertura del microobjetivo, λ'=λ/n . Para un microscopio de luz convencional, resolución (r r ):

Sin embargo, la principal ventaja de un microscopio confocal no es un aumento de la resolución en el sentido del criterio de Rayleigh, sino un aumento significativo del contraste. En particular, para un PSF convencional en el plano focal, la relación entre la amplitud del primer máximo lateral y la amplitud del máximo principal es del 2 %; para el caso de un microscopio confocal, esta relación será del 0,04 %.

La microscopía confocal proporciona un aumento en el contraste de la imagen mediante el uso de iluminación enfocada (excitación) en el área de análisis e iris de fluorescencia en el plano de la imagen. Este aumento de contraste da como resultado la posibilidad de resolver objetos con una diferencia de intensidad de hasta 200:1, y también proporciona un aumento de resolución, tanto en el plano del objeto como a lo largo del eje óptico. Además de aumentar el contraste, la microscopía confocal fluorescente permite proporcionar una reconstrucción tridimensional paso a paso del objeto en estudio mediante el uso de iluminación multipunto. Entre los métodos más avanzados de microscopía confocal de barrido, cabe destacar el uso de un disco de barrido con microdiafragmas y el uso de fotodetectores de matriz [2] .

Hoy en día, existen métodos que pueden aumentar significativamente la resolución de un microscopio confocal. En un microscopio confocal convencional, la luz de excitación se enfoca en un solo punto de la muestra, seguida de la detección de una señal fluorescente de emisión. La radiación de emisión fuera de foco es cortada por un agujero de alfiler (pinhole) cuyo tamaño determina cuántos máximos del disco de Airy llegarán al detector. Se puede lograr un aumento en la resolución al reducir el diámetro del diafragma (agujero de alfiler), pero la relación señal/ruido disminuirá significativamente debido a una disminución en la intensidad de la radiación de emisión que pasa a través del diafragma. Una alternativa a dicho escaneo es el uso de detectores de matriz [42] [43] , que registran simultáneamente la distribución de intensidad a lo largo del plano lateral de la muestra simultáneamente desde toda el área del disco de Airy, donde cada elemento fotosensible funciona como un abertura del agujero de alfiler. Así, utilizando el algoritmo de detección con un detector de matriz de 32 canales (Airyscan [44] [45] ), se demostró que es posible superar el límite de resolución clásico (límite de difracción) en más de 1,7 veces en las tres dimensiones: hasta 140 nm lateral y 400 nm axialmente a una longitud de onda de 488 nm [46] [47] [48] [49] [50] [51] [52] .

Aplicación

CLSM se usa ampliamente en casi todas las ramas de la biología, desde la biología celular y la genética hasta la microbiología y la biología del desarrollo. También se utiliza en óptica cuántica y espectroscopia e imágenes nanocristalinas.

biología y medicina

Clínicamente, el CLSM se utiliza para investigar diversas enfermedades oculares y, en especial, para la obtención de imágenes, el análisis cualitativo y la cuantificación de las células endoteliales de la córnea [53] . Se utiliza para localizar e identificar la presencia de filamentos de hongos filamentosos en el estroma corneal en casos de queratomicosis, lo que permite un diagnóstico rápido y una administración temprana de la terapia correcta. También parece prometedor realizar procedimientos endoscópicos ( endomicroscopia ) utilizando el método CLSM [54] . En la industria farmacéutica, se recomendó usar este enfoque para monitorear el proceso de producción de formas farmacéuticas de película delgada, para controlar la calidad y uniformidad de la distribución de sustancias medicinales.

Óptica y cristalografía

CLSM se utiliza como mecanismo de recuperación de datos en algunos sistemas de almacenamiento de datos ópticos 3D o mapeo de compuestos químicos, así como en física de semiconductores y espintrónica (en particular, en el estudio de las propiedades de los centros NV ). [55] [56] .

Un ejemplo de imágenes obtenidas por el método CLSM

• Una serie de imágenes confocales (z-stack) que demuestran la distribución de los filamentos de actina en la línea celular de osteosarcoma U2OS

• Reconstrucción 3D de una serie de imágenes confocales del núcleo de células HeLa fijadas, proteína quimérica transgénica histona H2B-GFP

• β-tubulina en ciliado Tetrahymena

• Sección de una hoja de Pteridium aquilinum

• Imagen confocal de una sección transversal de un tallo de Lycopodium annotinum

• Sección transversal de una hoja de Dryopleris filix-mas

• Imagen confocal de un fragmento de moneda "1 euro"

• Imagen confocal de doble canal de microtúbulos mitóticos

Véase también

• microscopia óptica
• Microscopio fluorescente
• Nanoscopia de fluorescencia
• Fluorescencia en la investigación biológica
• microscopía láser

Notas

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Enlaces

• Expresiones moleculares : microscopía confocal de barrido láser
• Microscopía de NikonU . Introducción completa a la microscopía confocal.
• Departamento de Física de Emory . Introducción a la microscopía confocal y fluorescencia.
• Descripción general de la microscopía confocal de Science Creative Quarterly  : imágenes de alta resolución también disponibles.
• Microscopio de matriz programable  (enlace no disponible)  - Capacidades del microscopio confocal.
• OPTELICS HYBRID  es un microscopio confocal láser y confocal de luz multifuncional.

diccionarios y enciclopedias	Britannica (en línea)
En catálogos bibliográficos	J9U : 987007549049205171 LCCN : sh90001543