El método de fijación local del potencial , patch-clamp ( ing. parche - fragmento, abrazadera aquí - fijación) - una técnica electrofisiológica para estudiar las propiedades de los canales iónicos , que consiste en el hecho de que un fragmento de la membrana celularaislado con una micropipeta especial. Esta técnica permite al experimentador controlar la diferencia de potencial entre los lados de la membrana, así como colocarla en un ambiente con una determinada composición química. Bajo estas condiciones bien controladas, se miden las corrientes iónicas que pasan a través de la membrana, lo que finalmente conduce a conclusiones sobre cómo los canales iónicos responden a la estimulación eléctrica y química. El método es tan sensible que permite observar el comportamiento y las transformaciones químicas de moléculas individuales que interactúan con la membrana. [1] Se han desarrollado protocolos experimentales para medir las características de los canales iónicos de manera óptima. Exploradores alemanes Erwin Neher y Bert Sakmanquien desarrolló esta técnica recibió el Premio Nobel en 1991.
Las células vivas están cubiertas por una membrana , cuya base estructural es una doble capa de lípidos , ligeramente permeable al agua y prácticamente impermeable a los iones. Cada célula debe intercambiar con el medio exterior diversas sustancias y, en particular, iones. El transporte de iones a través de la membrana juega un papel importante en los procesos de excitación celular y transmisión de señales. Los iones ingresan a la célula y la dejan a través de estructuras proteicas integradas en la membrana: canales y transportadores [2]
Los transportadores son proteínas de membrana que se unen a una sustancia transportada en un lado de la membrana, transportan esta sustancia a través de la membrana y luego la liberan. Tal transferencia se vuelve posible porque, como resultado de la conexión con una sustancia, el transportador cambia de conformación (es decir, forma, orientación). El transportador más importante en las células eucariotas es la bomba de sodio-potasio . Para que esta bomba funcione, se requiere energía, que extrae del ATP almacenado en la celda . Durante un ciclo de su funcionamiento, la bomba extrae 3 iones Na + de la celda e introduce 2 iones K + en ella . Una molécula de este transportador realiza alrededor de 10³ ciclos por segundo. Una frecuencia similar de ciclos es típica para otros tipos de transportadores [3] .
Los canales son proteínas que funcionan como poros de membrana, ya que forman aberturas a través de las cuales pueden pasar los iones. Los canales de membrana son selectivos , permeables solo para ciertas sustancias. La selectividad se debe al radio de los poros ya la distribución de los grupos funcionales cargados en ellos. Hay canales que pasan selectivamente iones de sodio (canales de sodio), así como canales de potasio, calcio y cloruro. Para cada tipo de ion, no hay uno, sino bastantes tipos de canales [4] . 10 6 - 10 7 iones pasan a través de un canal por segundo [3] .
A pesar de las diferencias fundamentales en el mecanismo de transporte a través de canales y transportadores, pueden estar formados por proteínas altamente homólogas. Así, recientemente se recibieron datos de que la mutación de un solo aminoácido en la proteína del transportador de metales divalentes DMT1 conduce a su transformación en un canal de calcio . Además, existe al menos un transportador (un intercambiador de cloruro-bicarbonato de eritrocitos) que realiza 10 5 transferencias por segundo [3] , lo que está muy cerca de las velocidades características de los canales, y sugiere la existencia de algún “intermedio” entre los canales y transportadores de mecanismos.
Dado que los iones son moléculas cargadas eléctricamente, cuando pasan a través de los canales de la membrana, la carga también se transfiere, lo que significa que una corriente eléctrica fluye a través de la membrana. Esta corriente se puede medir. Cuanto mayor sea la diferencia de potencial entre los lados de la membrana, mayor será la corriente. La conductividad (relación entre la corriente y la diferencia de potencial) de un solo canal en estado abierto varía según el tipo de canal, de 4 a 5 (en CFTR [5] y ENaC [6] ) a 30 a 50 (por ejemplo, en un receptor colinérgico sensible a la nicotina [7 ] ) picosiemens . Esto significa que con una diferencia de potencial de 100 mV, por el canal fluirá una corriente de varios picoamperios.
Los fenómenos eléctricos en las membranas celulares se pueden medir utilizando microelectrodos de vidrio afilados que se insertan en la célula. La técnica con un electrodo intracelular permite medir la diferencia de potencial a una corriente fija. Con menos frecuencia, esta técnica puede medir la corriente a un potencial fijo utilizando la técnica de pinza de conmutación. Todas las medidas se realizan exclusivamente en toda la célula, estudiando así las propiedades eléctricas de toda la membrana celular.
El hecho de que la fijación del potencial transmembrana permitirá medir la conductividad de la membrana a partir de cambios en la corriente a un voltaje constante se reconoció por primera vez en la década de 1940. Siglo XX, y pronto los investigadores ingleses Alan Hodgkin y Andrew Huxley ( Alan Hodgkin y Andrew Huxley ) comenzaron experimentos con abrazadera de potencial de dos electrodos (pinza de voltaje de 2 electrodos). [8] La esencia del método es la siguiente. Se insertan dos electrodos en la celda, uno más, el electrodo de referencia, permanece fuera de la celda. El primer electrodo intracelular sirve para medir la diferencia de potencial transmembrana (es decir, la diferencia de potencial entre éste y el electrodo de referencia), el segundo puede suministrar corriente. No es posible utilizar el mismo electrodo afilado para el suministro de corriente y la medición de la diferencia de potencial. El hecho es que dicho electrodo tiene una resistencia eléctrica de entrada del orden de 100-200 MΩ, que es comparable a la resistencia de la membrana celular, por lo tanto, si la corriente fluye a través del sistema "electrodo-celda", entonces la caída de voltaje en el electrodo será proporcional a la caída de tensión en la propia membrana, y no hay forma de separar estas dos partes [8] . Además, un dispositivo especial, un generador de señales , establece el potencial de comando , que debe ser igual al potencial transmembrana. El potencial transmembrana medido se alimenta a la entrada del dispositivo de comparación , que resta el potencial medido del de comando y, dependiendo de la magnitud de la diferencia, suministra corriente al electrodo de corriente de tal manera que compense esta diferencia. El monitor de corriente , a su vez, mide constantemente la cantidad de corriente que se requiere para ello. En las décadas de 1940 y 1950, cuando trabajaban Hodgkin y Huxley, no había microelectrodos, por lo que se usaban alambres delgados como electrodos intracelulares. Esto determinó la elección del objeto: un axón de calamar gigante de 1 mm de diámetro, en el que se insertaron estos cables. Sobre este objeto, utilizando el método de fijación de potencial de dos electrodos, los investigadores realizaron experimentos en los que se estableció la naturaleza iónica del potencial de acción y se postuló por primera vez la existencia de canales iónicos (Premio Nobel en 1963 , compartido con J. Eccles , quien lo recibió para la investigación en el campo de la transmisión sináptica). La sujeción potencial de dos electrodos todavía se usa hoy en día, utilizando microelectrodos de vidrio afilados, pero incluso con ellos, esta técnica tiene limitaciones significativas: solo se pueden insertar dos electrodos en una célula muy grande (por ejemplo, un ovocito de rana).
A finales de los años setenta del siglo XX. Erwin Neher (E.Neher) y Bert Sakman (B.Sakmann) descubrieron que las pipetas de vidrio en forma de cono con un diámetro de punta de 1-2 micras pueden formar contactos con la membrana celular (límite membrana-vidrio) con una resistencia de varios gigaohmios - esto se llama un contacto de gigaohmios . Te permite aislar del medio exterior y del resto de la membrana ese fragmento que se encuentra en el interior de la pipeta. El fragmento de la membrana delimitado por la pipeta se llama parche - "fragmento", la palabra pinza (fijación) en el nombre del método puede interpretarse tanto como captura y aislamiento de este fragmento, como fijación del potencial transmembrana en un fragmento aislado o, como se describirá más adelante, potencial o corriente en toda la celda. [9] Un electrodo de plata-cloro se coloca en una pipeta llena de una solución electrolítica, el segundo electrodo se coloca extracelularmente, en el líquido de lavado. El circuito eléctrico difiere del descrito anteriormente para la fijación de dos electrodos en que se utiliza el mismo electrodo tanto para medir la diferencia de potencial como para aplicar corriente, lo cual es posible debido a la resistencia relativamente baja de la pipeta.
La foto 1 muestra parte de tal configuración.
Una enorme esfera, parte de la cual es visible en el monitor en el centro de la foto, es una célula (un ovocito de la rana Xenopus laevis ), que actualmente se encuentra en la platina del microscopio, se le conecta una pipeta de parche, su diámetro en la nariz es de unas 3 micras. Después de establecer un contacto de gigaohmios, aísla un fragmento de la membrana con un área de aproximadamente 7 μm², se puede registrar la corriente de los canales iónicos en este fragmento.
La configuración que se acaba de describir se denomina abrazadera de parche adjunta a la celda (parche-abrazadera). Se ilustra en la Figura 2.
Esta configuración, sin embargo, tiene dos desventajas.
En primer lugar, no permite medir con la suficiente fiabilidad y, en consecuencia, fijar la diferencia de potencial transmembrana, ya que ambos electrodos, tanto el de pipeta como el externo, se encuentran en el mismo lado de la membrana. En términos generales, es posible, utilizando una solución de lavado con una composición iónica que imita la composición del citoplasma , para despolarizar la membrana fuera de la pipeta, de modo que desaparezca la diferencia de potencial entre el electrodo externo y el citoplasma, y luego la diferencia de potencial entre los electrodos será igual al potencial transmembrana, pero todo esto es muy aproximado, ya que desconocemos la composición exacta del citoplasma.
En segundo lugar, esta configuración no permite controlar la composición del medio fuera de la pipeta: el citoplasma permanece allí, cuya composición no está completamente determinada.
Sin embargo, hasta cierto punto, esta característica de la configuración de celda adjunta también es una ventaja: esta configuración le permite trabajar en condiciones más cercanas a las fisiológicas.
Sin embargo, si se retira la pipeta de la celda con un movimiento rápido, entonces la parte “interior” de la membrana se desprenderá de la celda y se obtendrá una configuración de adentro hacia afuera (parte externa hacia adentro), llamada así porque la parte interna El lado de la membrana, generalmente hacia el citoplasma, estará afuera, en la solución de lavado, y el exterior está dentro de la pipeta. (Esquema 3.) Un método alternativo de transición a la configuración de adentro hacia afuera es el siguiente: desde la configuración de celda adjunta, la pipeta se retira suavemente, formando una vesícula cerrada en ambos lados; luego levante la pipeta al aire y bájela al segundo baño, con solución intracelular. Durante la transferencia, la membrana externa de la vesícula se destruye, lo que da como resultado la formación de una configuración de adentro hacia afuera.
Ahora la diferencia de potencial a través del fragmento de membrana es estrictamente igual a la diferencia de potencial entre los electrodos. Obviamente, cuando se usa esta modificación, la pipeta se llena con una solución que imita el entorno extracelular, mientras que la solución de lavado tiene una composición similar a la del citoplasma . Al mismo tiempo, al cambiar la composición de la solución de lavado, es posible estudiar cómo tales cambios en el citoplasma afectan la corriente de los canales que nos interesan; después de todo, la solución de lavado entra en contacto con el lado citoplasmático de la membrana. . Al mismo tiempo, conocemos con exactitud tanto la composición del líquido a ambos lados de la membrana como la diferencia de potencial, lo que nos permite caracterizar con precisión los canales utilizando las ecuaciones biofísicas de Nernst y Goldman-Hodgkin-Katz. Al mismo tiempo, si un canal entra en una sección aislada de la membrana, entonces observamos el comportamiento de una sola molécula y, si es un receptor de canal regulado por ligando , entonces su interacción con otras moléculas individuales.
Si, según las condiciones del experimento, es necesario cambiar la composición del medio extracelular , se puede utilizar la configuración de toda la célula . En este caso, la pipeta no se retira de la célula, sino que se le aplica presión negativa y, por lo tanto, se destruye el fragmento aislado de la membrana.
Después de eso, la pipeta se conecta al entorno intracelular; como la célula suele ser pequeña, entonces, debido a la difusión , la composición del citoplasma pronto resulta ser idéntica a la composición de la solución de pipeta, por lo tanto, como en el caso anterior, conocemos tanto la composición de los líquidos como la diferencia de potencial. Tenga en cuenta que si en la configuración de adentro hacia afuera el electrodo de pipeta era "extracelular" y el electrodo interno era "intracelular", ahora han invertido sus roles. Desde el punto de vista del estudio de la corriente a través de los canales, la ventaja de este método es que aquí se conservan las estructuras celulares y los mecanismos reguladores. Es cierto que las sustancias de bajo peso molecular pueden difundirse desde el citoplasma hacia la pipeta y viceversa, de modo que no se puede lograr la conservación completa de los mecanismos reguladores en esta configuración. Se puede considerar una cierta desventaja de la configuración que se mide la corriente total de todos los canales en la celda, y no las corrientes a través de canales individuales, es decir, la resolución de este método es menor que la de las configuraciones con membrana rota.
Para solucionar el problema de la resolución reducida del método, se permite la configuración outside-out (outer side outside). Si, después de cambiar al modo de celda completa, la pipeta se retira lentamente de la celda, la membrana no se desprende de inmediato, sino que comienza a estirarse dentro del tubo; esto se puede ver en la foto 5.
Tenga en cuenta que las piezas de citoplasma son claramente visibles en la pipeta , que llegaron allí después de la destrucción de la membrana durante la transición a la célula completa.
La siguiente fase del proceso se muestra en la foto 6.
El tubo de la membrana se ha vuelto muy delgado y casi invisible (“ prominencia ” en la superficie celular es una pequeña parte del citoplasma que queda en el tubo de la membrana). En el momento siguiente, el tubo se romperá y la membrana se cerrará sobre la pipeta en forma "invertida": nos encontraremos en una configuración "afuera".
Entonces, la pipeta y su electrodo, como la configuración de célula completa, son intracelulares, cambiamos libremente la composición de la solución extracelular, el área de la membrana bajo estudio es pequeña, por lo que podemos estudiar nuevamente canales individuales.
El parche perforado es una variante específica de patch-clamp en modo de celda completa. En este caso, la solución de la pipeta contiene una pequeña cantidad de un antibiótico especial , por ejemplo, anfotericina-B o gramicidina . Los antibióticos de esta clase forman canales iónicos en la membrana celular en el sitio adherido a la micropipeta.
Este enfoque permite evitar reemplazar el ambiente interno de la celda con una solución de pipeta-electrodo, es decir, la celda permanece viva con el menor daño posible. Por lo tanto, las respuestas de la célula a los estímulos son lo más cercanas posible a las naturales. Al mismo tiempo, este método tiene una serie de desventajas. Primero, en comparación con el modo clásico de celda completa, la resistencia eléctrica de entrada (que consiste principalmente en la resistencia de la pipeta y la resistencia en la unión de la pipeta con la membrana) es significativamente mayor. Esto reduce la calidad de la sujeción potencial, aumenta el nivel de ruido durante la grabación y aumenta los valores de todos los errores asociados con los cambios en la resistencia del circuito completo (desde el electrodo en la solución externa hasta el electrodo en la pipeta). En segundo lugar, el antibiótico tarda bastante tiempo (hasta 30 minutos) en funcionar, lo que reduce significativamente el período útil del experimento. Y, en tercer lugar, el antibiótico también daña la membrana en la unión con la punta de la pipeta, lo que conduce a una destrucción acelerada del contacto de gigaohmios y, además, reduce el tiempo experimental efectivo. Por lo tanto, esta versión del método puede usarse con éxito solo en experimentos que no requieren mucho tiempo para estudiar los fenómenos en estudio.
Una variación interesante de patch-clamp es el parche nucleado. (Fijando el potencial con el núcleo celular [11] ).
El método es como sigue. La pipeta se lleva a la celda y luego rompe bruscamente la membrana. Después de eso, la punta de la pipeta se lleva al núcleo de la célula, se aplica una ligera presión negativa a la pipeta. Como resultado, la pipeta se pega al núcleo. Luego, la pipeta con el núcleo en el extremo se retira suavemente y se retira de la jaula. La pipeta debe sacarse de la célula de tal manera que la sección de la membrana en el punto de salida “enganche” el núcleo adherido y se rompa, envolviéndolo. El resultado es una versión específica del parche de afuera hacia afuera, en el que una sección mucho más grande de la membrana que en la versión habitual del método se une al extremo de la pipeta y se envuelve alrededor del núcleo celular.
Cuando se estudian cambios en la conductancia de canales del mismo tipo en respuesta a alguna acción química o la dependencia de su conductancia de la diferencia de potencial a través de la membrana, es conveniente fijar el potencial y medir la corriente del canal, como hemos descrito. hasta aquí. Este, el tipo más común de abrazadera de parche, se llama abrazadera de tensión. Sin embargo, a veces un investigador está interesado en los procesos de transporte de iones transmembrana asociados con un cambio en el potencial de membrana, por ejemplo, la conducción de un impulso nervioso. En tales casos, puede hacer lo contrario: fijar la corriente en un nivel constante y estudiar los cambios en la diferencia de potencial en este caso. Esta opción se denomina pinza amperimétrica (fijación de corriente).
Registro de un solo canal del receptor de glicina . Se ven claramente dos estados: cerrado (corresponde a corriente cero) y abierto (corresponde a una corriente de unos 7 picoamperios). El canal pasa espontáneamente de un estado a otro de vez en cuando, no hay estados intermedios. El registro le permite obtener dos de las características más importantes del canal: la conductividad (basada en los valores del potencial y la corriente transmembrana) y la probabilidad de estar en estado abierto (definida como la relación del tiempo en que el canal está abierto en el momento en que se registra la corriente). Por cierto, la mayoría de las veces la actividad del canal se regula fisiológicamente al cambiar esta probabilidad.
Entrada en la configuración de celda completa. Célula epitelial del conducto colector. Potencial transmembrana −60 mV. A intervalos de 1 minuto durante 30 segundos, se inyecta amilorida, un inhibidor del canal de sodio epitelial, en la solución de lavado (el tiempo de administración se muestra mediante rectángulos oscuros). Por cierto, la sensibilidad a los inhibidores es otra de las características más importantes del canal. La introducción de amilorida cada vez conduce a una caída de la corriente a cero, lo que implica que casi toda la conductividad a -60 mV en esta celda es la conductividad del canal de sodio epitelial . A diferencia de la grabación anterior, los cambios actuales parecen ser continuos; esto se debe al hecho de que se graban muchos canales al mismo tiempo (alrededor de 2000), respectivamente, hay aproximadamente 2000 niveles actuales, desde "todo abierto" hasta "todo cerrado".
Esta es una técnica desarrollada para aumentar la productividad en electrofisiología cuando se requieren mediciones masivas de conductancia transmembrana. En particular, este método encuentra aplicación en la investigación farmacológica. Si con una abrazadera de parche clásica, la pipeta se coloca en una celda estacionaria, entonces, con una plana, por el contrario, la suspensión celular se aplica a un microchip con orificios ordenados de diámetro subcelular. La celda se asienta en el orificio, lo succiona con la ayuda de una bomba, como resultado de lo cual se forma un contacto de gigaohmios. Además, el estudio se lleva a cabo según el mismo principio que en el patch-clamp tradicional. [12] [13]
La principal ventaja de la abrazadera de parche plana es que el experimento es mucho más simple, requiere menos habilidad por parte del investigador y toma menos tiempo. Bastantes mediciones se pueden realizar una tras otra automáticamente. Según los autores de la técnica, este método facilita la perfusión de los contenidos intracelulares, así como la dosificación más precisa de las sustancias farmacológicas estudiadas o ensayadas. Con este método, es relativamente fácil trabajar con células que normalmente están en suspensión, en particular, con células sanguíneas.
Sin embargo, el método de abrazadera de parche plano tiene una serie de limitaciones significativas. Lo principal es que las células estudiadas deben estar en suspensión. En consecuencia, no es posible trabajar con fragmentos de tejido, es imposible estudiar la interacción de las células entre sí. Para movilizar las células, es necesario utilizar enzimas proteasas que puedan modificar el comportamiento de los canales iónicos estudiados.
Todo lo anterior lleva al hecho de que la abrazadera de parche plano encuentra aplicación principalmente en estudios de detección farmacológica donde se requieren mediciones de masa, pero no es tan común en el campo de la ciencia básica.