Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

La reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (o PCR cuantitativa, qPCR, PCR-RT, ing.  Real-time PCR, qPCR ) es un método de laboratorio basado en el método de reacción en cadena de la polimerasa que le permite determinar no solo la presencia del nucleótido objetivo secuencia en la muestra, sino también medir el número de copias. La cantidad de ADN amplificado se mide después de cada ciclo de amplificación utilizando marcadores fluorescentes : sondas o intercaladores. La evaluación puede ser cuantitativa (medida del número de copias de la plantilla) y relativa (medida relativa al ADN introducido o genes de calibración adicionales ) [1] .

Un método de PCR cuantitativa modificada se denomina PCR semicuantitativa (PCR semicuantitativa). A menudo se utiliza para comparar la expresión de múltiples genes. En este caso, la cantidad de producto acumulado se mide solo en un punto, después de que se detiene la reacción. [2]

La PCR en tiempo real a menudo se combina con otros métodos: RT-PCR ( RT-qPCR ) , ChIP - qPCR, etc. [3]

Descripción del método

El procedimiento de qPCR es similar al procedimiento de PCR clásico , es decir, todas las etapas de la reacción están presentes: fusión del ADN de doble cadena a una temperatura de 95 °C, hibridación de los cebadores (la temperatura de hibridación depende de los cebadores utilizados) y elongación a una temperatura de 72˚C si se usa Taq polimerasa . La cantidad de producto de PCR se mide en cada ciclo de PCR utilizando marcadores fluorescentes . Así, la fuerza de la señal indica la cantidad inicial de la molécula de interés [4] .

Gráfico de amplificación

La nomenclatura comúnmente utilizada para qPCR es:

  1. La línea de base son ciclos de PCR en los que la señal fluorescente está por debajo del valor que el instrumento puede detectar.
  2. ΔRn es el incremento de la señal fluorescente en cada instante de tiempo.
  3. La línea de umbral es un nivel arbitrario de fluorescencia seleccionado en función de la línea de base. Una señal que se detecta por encima del umbral se considera una señal real, que se puede utilizar para determinar el ciclo de umbral (Ct) para la muestra. El umbral se puede ajustar para que cada experimento esté en la región exponencial en todas las parcelas.
  4. El número umbral de ciclos (Ct) es el número de ciclos de PCR en los que la fluorescencia supera el valor umbral.

El gráfico consta de una línea de base, una fase exponencial y una meseta [5] .

En las etapas iniciales, la fluorescencia es débil, ya que hay poco producto, por lo que es difícil distinguirlo del fondo. A medida que se acumula el producto, la señal crece exponencialmente al principio y luego alcanza una meseta. La meseta se debe a la falta de uno u otro componente de la reacción: cebadores , trifosfatos de nucleótidos , una etiqueta fluorescente puede agotarse. Si se ha acumulado demasiado producto de reacción, entonces la polimerasa puede convertirse en un factor limitante , y luego la dependencia de la cantidad de producto en el ciclo se volverá lineal . Vale la pena señalar que en una reacción de PCR en tiempo real estándar, todas las muestras se estabilizarán y alcanzarán aproximadamente el mismo nivel de señal. Por lo tanto, el punto final no dirá nada sobre la cantidad inicial de la muestra de prueba. Por otro lado, en la fase exponencial se pueden rastrear diferencias en la tasa de crecimiento de la cantidad de producto. Las diferencias en el número inicial de moléculas afectan al número de ciclos necesarios para elevar el nivel de fluorescencia por encima del nivel de ruido [5] .

Ct es un número que se puede usar para juzgar la cantidad de ADN objetivo en la solución, pero el valor de Ct puede depender de muchos factores aleatorios, como la sensibilidad del detector , la calidad del filtro, etc. Por lo tanto, la cantidad inicial exacta del producto de interés no se puede medir Existen métodos de normalización para resolver este problema . Mida la relación de las cantidades de dos moléculas en la muestra. Por lo general, se normalizan a los productos de los genes domésticos  : genes, cuyo número en una célula es siempre aproximadamente el mismo (un ejemplo es el gen infA, que codifica el factor de iniciación de la traducción en las bacterias ) . La relación se determina mediante la siguiente fórmula:

donde y  son las cantidades iniciales de las dos muestras, Ct B y Ct A  son los valores Ct correspondientes, y  es la eficiencia de la PCR, que a menudo se equipara a o [5] .

Análisis de la curva de fusión

La PCR en tiempo real permite la identificación de fragmentos de ADN amplificados específicos mediante un análisis de su temperatura de fusión (desnaturalización), también conocida como valor Tm. El método utiliza tintes intercalados , generalmente SYBR Green . El punto de fusión del ADN es específico del fragmento amplificado. Los resultados de este método se obtuvieron comparando las curvas de disociación de las muestras de ADN analizadas. Se trazan dos curvas de fusión para el análisis. El primero es la dependencia de la fluorescencia con el tiempo, el segundo es la tasa de caída de la fluorescencia con el tiempo. El pico refleja un patrón de ADN específico [5] .

Clasificación de los fluoróforos usados

Definición no específica: PCR cuantitativa con colorantes de unión a ADN de doble cadena como indicadores

En este caso, el marcador es un compuesto químico capaz de incorporarse a la doble hélice del ADN . Tal sonda cambia su conformación al interactuar con los productos de la PCR y se convierte en un fluoróforo . La determinación del producto se puede realizar al final de cada ciclo, antes del paso de desnaturalización . Un ejemplo de este tipo de pintura es el ampliamente utilizado SYBR Green. Sin embargo, los tintes de ADN de doble cadena (dsDNA) se unirán a todos los dsDNA, incluidos los productos de PCR no específicos (como el dímero de cebador ). Esto puede interferir potencialmente con la precisión de la monitorización de la secuencia objetivo [6] .

Definición específica: sonda indicadora fluorescente

Las sondas fluorescentes detectan solo la secuencia que contiene ADN complementaria a la sonda; por lo tanto, el uso de una sonda informadora aumenta en gran medida la especificidad y permite una medición más precisa en presencia de otro dsDNA . Sin embargo, las sondas indicadoras fluorescentes no evitan el efecto inhibidor de los dímeros de cebadores, que pueden suprimir la acumulación de productos de reacción diana [7] .

También es posible utilizar varias sondas cuyos fluoróforos tengan diferentes espectros de emisión . En este caso, es posible registrar una señal de diferentes moléculas de ADN en un tubo. El método se llama PCR múltiple (ing. multiplex PCR ) [8] .

El método se basa en la introducción de una sonda de ADN complementaria al producto de amplificación con un indicador fluorescente en un extremo de la sonda y un extintor de fluorescencia en el extremo opuesto. Cuando el extintor está muy cerca del reportero, absorbe la señal y el reportero no emite fluorescencia . Durante la amplificación , la integridad de la sonda se rompe y el reportero puede detectarse por fluorescencia después de la excitación con láser. Por lo tanto, aumentar la cantidad de producto al que se une la sonda indicadora en cada ciclo de PCR provoca un aumento proporcional de la fluorescencia . Las etiquetas pueden emitir fluorescencia en la fase de elongación o en la fase de recocido de la PCR [4] .

Un fluoróforo y su extintor se cosen a la sonda desde los extremos 5' y 3' . Si la secuencia de la sonda no es muy larga, incluso en el estado unido al ADN interactuarán entre sí y no se emitirá fluorescencia. Durante la elongación , la ADN polimerasa , que tiene actividad exonucleasa 5'-3' (a menudo Taq polimerasa ), disocia la sonda del ADN objetivo un nucleótido a la vez. Como resultado de este proceso, tanto el fluoróforo como su extintor entrarán en la solución, donde la probabilidad de encontrar estas sustancias cerca será pequeña y se restablecerá la fluorescencia [4] .

  1. Una horquilla fluorogénica  es una pequeña molécula de ADN monocatenario que, en su estado libre, es capaz de formar una estructura espacial especial de ADN: una horquilla . Un fluoróforo se cose a un extremo de la cadena y una sustancia que lo apaga se cose al otro. La secuencia de la sonda es complementaria al ADN diana. En este caso, aquellas moléculas de sonda que flotan en la solución no darán una señal fluorescente, y aquellas unidas a las moléculas de ADN sufrirán cambios conformacionales , lo que resultará en la separación espacial del fluoróforo y su extintor y la restauración de la fluorescencia. Es recomendable realizar el registro después de la desnaturalización [4] .
  2. Una etiqueta basada en el método FRET . La base de este método es la presencia de dos sondas que se unen al ADN objetivo a poca distancia entre sí. Se sutura un donante de fluoróforo y un aceptor de fluoróforo al extremo 5' de una sonda y al extremo 3' de la segunda sonda , respectivamente. Cuando están muy juntos, el fluoróforo donante absorbe luz de cierta longitud de onda y emite un brillo en un espectro de longitud de onda más largo . Esta onda, a su vez, es absorbida por el fluoróforo aceptor y emite la luz registrada. [4] .

Aplicación

La PCR en tiempo real se usa ampliamente para muchas aplicaciones de investigación en laboratorios. Además, este método ha encontrado aplicación en medicina (para diagnosticar enfermedades) y en el campo de la biotecnología (para determinar el contenido de microorganismos en alimentos y materiales vegetales; para detectar OMG ). qPCR también se utiliza para el genotipado y la cuantificación de virus y otros patógenos humanos.

Investigación científica

Cuantificación de la expresión génica

qPCR se utiliza como uno de los métodos para las mediciones cuantitativas de la transcripción de genes . Este método se usa ampliamente para evaluar cambios en la expresión de un gen en particular a lo largo del tiempo , por ejemplo, en respuesta a la administración de un fármaco o cambios en las condiciones ambientales. La cuantificación de la expresión génica mediante métodos tradicionales de detección de ADN no es fiable. La detección de ARNm por transferencia Northern , productos de PCR en gel o transferencia Southern no permite una cuantificación precisa. Por ejemplo, dentro de los 20 a 40 ciclos de una PCR típica, la cantidad de producto de ADN alcanza una meseta que no está directamente relacionada con la cantidad de ADN diana en la PCR inicial [9] .

La PCR en tiempo real se puede utilizar para cuantificar los ácidos nucleicos mediante dos métodos comunes: cuantificación relativa y cuantificación absoluta [10] . La cuantificación absoluta proporciona el número exacto de moléculas de ADN diana utilizando una curva estándar . Por lo tanto, es importante que la PCR de la muestra y el estándar tengan la misma eficiencia de amplificación . La puntuación relativa se basa en genes de referencia internos (genes de mantenimiento ) para determinar las diferencias en la expresión del gen objetivo. La cuantificación se expresa como un cambio en los niveles de expresión del ARNm interpretado como ADN complementario ( ADNc , generado por transcripción inversa del ARNm ). La cuantificación relativa es más fácil de realizar porque no requiere una curva de calibración ya que la cantidad del gen en estudio se compara con la cantidad del gen de control [11] .

qPCR para determinar la cantidad de ARN nuclear pequeño (snRNA)

Los ARN nucleares pequeños (ARNsn) difieren en propiedades de los ARNm por una longitud muy corta (alrededor de 22 nucleótidos ), no tienen una secuencia conservadora en los extremos, mientras que los ARNsn de una población pueden diferir en uno o más nucleótidos . Para resolver estos problemas, se utilizan enfoques basados ​​en la adición de una pequeña porción de ADN (enlazador) al ADNc en una reacción de transcripción inversa . Luego, la PCR en tiempo real se lleva a cabo mediante métodos estándar que utilizan cebadores, (biología) complementarios al enlazador [12] .

Estudios genómicos usando ChIP-qPCR

La inmunoprecipitación de cromatina (ChIP) en combinación con RT-qPCR se considera el método básico en la investigación genómica , su disponibilidad comercial y alta precisión permiten un análisis rápido y fácil de las interacciones proteína-ADN. ChIP-qPCR se utiliza para investigar genes específicos y posibles regiones reguladoras, como los promotores . Este método se utiliza actualmente en varios estudios, incluida la diferenciación celular , el silenciamiento de genes supresores y el efecto de las modificaciones de histonas en la expresión génica [13] .

El análisis de ChIP captura solo una fracción de los posibles objetivos presentes en todo el genoma debido a la variabilidad en la eficiencia de entrecruzamiento y la limitación estérica de la disponibilidad de anticuerpos [13] .

Para realizar ChIP-qPCR, es necesario agregar la mezcla maestra (una mezcla de enzimas y nucleótidos ), cebadores y ADN molde. En este caso, es necesario seleccionar con precisión la concentración de cebadores para una amplificación eficaz del ADN diana. El ADN de ChIP sirve como plantilla o, en el caso de un control negativo, perlas vacías sin ADN. Luego es necesario elegir el tiempo y la temperatura de los ciclos de recocido, e iniciar la PCR. Los resultados se analizan de manera similar a los resultados de qPCR, comparando el número umbral de ciclos (Ct) para la plantilla de entrada y la plantilla de ADN de ChIP [3] .

Diagnósticos médicos

La PCR cuantitativa se utiliza para identificar rápidamente genes o fragmentos de ADN que son marcadores de enfermedades infecciosas , anomalías genéticas, etc. La introducción de este método en los laboratorios clínicos ha mejorado significativamente la calidad del diagnóstico de enfermedades infecciosas [14] . Además, la qPCR se utiliza como herramienta para la detección de enfermedades emergentes. Por ejemplo, nuevas cepas de influenza [15] .

El uso de qPCR también permite mediciones cuantitativas y genotipificación (caracterización de cepas) de virus , como el virus de la hepatitis B [16] . El grado de infección , que se mide como el número de copias del genoma viral por unidad de tejido del paciente, es de gran importancia. Por ejemplo, la probabilidad de reactivación del virus del herpes simple tipo 1 depende del número de ganglios infectados [17] .

En pacientes con sospecha de infección por coronavirus , se toma un frotis de garganta, se extrae el ARN y se analiza por RT-qPCR . Los genes diana son el marco de lectura abierto 1ab (ORF1ab) y la proteína de la nucleocápside (N). Un umbral de ciclo (valor Ct) de menos de 37 se define como un resultado de prueba positivo, y un valor de Ct de 40 o más se define como un resultado de prueba negativo. Estos criterios diagnósticos se basan en las recomendaciones del Instituto Nacional para el Control y Prevención de Enfermedades Virales [18] .

La sensibilidad de la prueba RT-qPCR es del 83,3%, esta prueba es propensa a resultados falsos negativos . La tomografía computarizada también se utiliza para diagnosticar coronavirus , cuya sensibilidad es mucho mayor y asciende al 97,2% [19] .

La PCR cuantitativa también se usa ampliamente para detectar células tumorales en tumores sólidos [20] [21] e incluso en algunas formas de leucemia [22] [23] .

qPCR ayuda en la detección de células tumorales circulantes . Por ejemplo, el cáncer de mama sigue siendo la causa más común de muerte entre los pacientes con cáncer. Además, la muerte suele ser causada por metástasis que han surgido . Las metástasis se producen como consecuencia de que las células capaces de proliferar se separan del tumor , entran en el torrente sanguíneo y se asientan de nuevo en alguna parte del cuerpo. Estas células se denominan células madre circulantes (CSC). La presencia de tales células en la sangre de pacientes con cáncer de mama, por regla general, se asocia con un mal pronóstico del resultado de la terapia y la supervivencia en general, por lo tanto, es un parámetro de diagnóstico muy importante. Pero debido al número muy bajo, identificar CVT  es una tarea difícil.

Y qPCR como método altamente sensible se puede utilizar para resolver este problema. Los CST son de origen epitelial y, por lo tanto, expresan un determinado conjunto de genes que los diferencia de las células sanguíneas que los rodean , que son de origen mesenquimatoso . Para aplicar este método, es necesario determinar el conjunto de genes marcadores CST y evaluar su nivel de expresión [24] .

En microbiología

La PCR en tiempo real también se utiliza para trabajos microbiológicos en el campo de la seguridad alimentaria, para evaluar la calidad del agua (aguas potables y residuales) y en el campo de la salud pública [25] . Además, este método se utiliza para identificar la microflora intestinal [26] .

Detección de fitopatógenos

La agroindustria produce semillas y plántulas libres de patógenos para evitar pérdidas económicas y aumentar la vida útil de los productos. Por lo tanto, se han desarrollado sistemas para detectar pequeñas cantidades de phytophthora ( Phytophthora ramorum ), oomicetos y algunos otros patógenos que matan robles y otras especies de plantas mezcladas con el ADN de la planta huésped. La capacidad de distinguir entre el ADN del patógeno y el de la planta hospedante se basa en la amplificación de las secuencias ITS ( intern transcripted spacer) , regiones internas transcritas ubicadas en la región codificante del gen del ARN ribosomal , que son características de cada taxón [27]. ] .

Identificación de organismos modificados genéticamente

La qPCR (utilizando transcripción inversa ) se puede utilizar para detectar organismos modificados genéticamente , ya que es más sensible que muchos otros métodos. En este caso, se utilizan cebadores específicos para amplificar las secuencias promotoras, terminadoras o intermedias utilizadas en el proceso de creación del vector . Dado que el proceso de creación de una planta transgénica suele dar lugar a la inserción de más de una copia del transgén , su cantidad también suele estimarse mediante qPCR. En este caso, se utiliza como control una planta que contiene este gen en una sola copia [28] [29] .

Notas

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