La ADP-ribosilación ( ADP-ribosilación ) es una reacción química de agregar uno o más residuos de ADP-ribosa a una proteína [1] [2] . Es una modificación postraduccional reversible que desempeña un papel importante en muchos procesos celulares , como la transducción de señales , la reparación del ADN , la regulación de la expresión génica y la apoptosis [3] [4] . Se ha observado una ribosilación de ADP incorrecta en algunas formas de cáncer [5] . Muchas toxinas bacterianas , como la toxina del cólera y la toxina de la difteria , afectan la ribosilación del ADP [6] .
Las primeras suposiciones sobre la existencia de una modificación postraduccional de proteínas como la ADP-ribosilación aparecieron en la década de 1960. Durante este tiempo, Pierre Chambon y sus colaboradores descubrieron que el extracto de granos de pollo absorbía ATP [7] . Estudios posteriores mostraron que ADP-ribosa, un derivado de NAD + , entró en la reacción . Unos años más tarde, se identificó una enzima que une la ADP-ribosa a las proteínas, se denominó poli(ADP-ribosa) polimerasa . Al principio, se pensó que la poli-(ADP-ribosa) era una cadena lineal de residuos de ADP-ribosa conectados por enlaces glucosídicos . Posteriormente se demostró que cada 20-30 residuos la cadena puede ramificarse [8] .
La mono-ADP-ribosilación se describió unos años más tarde cuando se descubrió que se requería NAD + para que la toxina de la difteria fuera activa . La toxina se activa cuando la enzima mono-ADP-ribosiltransferasa une un residuo de ADP-ribosa. Inicialmente, se pensó que la poli-ADP-ribosilación estaba involucrada solo en la regulación de la expresión génica. Sin embargo, a medida que se encontraron nuevas enzimas que realizaban la ribosilación de ADP, se hizo evidente la importancia funcional versátil de esta modificación. Aunque la primera enzima de mamífero conocida capaz de realizar poli-ADP-ribosilación se descubrió a fines de la década de 1980, las siguientes proteínas de mamífero con tal actividad no se describieron hasta 15 años después [9] . A fines de la década de 1980, también se descubrieron las enzimas ADP-ribosilciclasa, que catalizan la adición de ADP-ribosa cíclica a las proteínas. Resultó que las proteínas de la familia de las sirtuinas , que pueden catalizar la desacetilación dependiente de NAD + , también tienen actividad mono-ADP-ribosiltransferasa [10] [11] .
Por regla general, NAD + sirve como fuente de residuos de ADP-ribosa . En esta reacción de transferencia, se rompe el enlace N-glucosídico en NAD + que une ADP-ribosa al grupo nicotinamida , después de lo cual el grupo lateral del aminoácido modificado lleva a cabo un ataque nucleofílico . Las ADP-ribosiltransferasas catalizan dos tipos de reacciones: mono-ADP-ribosilación y poli-ADP-ribosilación.
Las mono-ADP-ribosiltransferasas catalizan más comúnmente la adición de un solo residuo de ADP-ribosa a la cadena lateral de arginina a través de un motivo específico (RS-EXE). Primero, el enlace entre ADP-ribosa y nicotinamida se rompe con la formación de un ion oxonio . La cadena lateral de arginina de la proteína modificada actúa entonces como un nucleófilo y ataca al átomo de carbono electrofílico junto al ion oxonio . Antes del ataque nucleofílico, la arginina es desprotonada el residuo de glutamato de la enzima . Otro residuo de glutamato conservador forma un enlace de hidrógeno con uno de los grupos hidroxilo de la ribosa , lo que facilita el ataque nucleofílico. Como resultado de la ruptura del enlace, se libera nicotinamida. La modificación puede ser eliminada por las enzimas ADP-ribosil hidrolasa, que rompen el enlace N-glucosídico entre la arginina y la ribosa, liberando ADP-ribosa y proteína no modificada. Sin embargo, NAD + no se forma en la reacción inversa [12] .
Las poli(ADP-ribosa) polimerasas ( Ing. Poly-(ADP-ribose) polymerasees, PARP ) se encuentran predominantemente en eucariotas y catalizan la adición de varios residuos de ADP-ribosa a una proteína. Al igual que con la mono-ADP-ribosilación, la fuente de ADP-ribosa es NAD + . Los PARP utilizan la tríada catalítica His - Tyr -Glu para mejorar la unión a NAD + y unir la cadena de poli-ADP-ribosa ensamblada a la proteína. El residuo de glutamato facilita la formación de un enlace O-glucosídico entre dos residuos de ribosa [13] . Hay varias otras enzimas que reconocen cadenas de poli-ADP-ribosa, las hidrolizan o forman ramificaciones. Se han encontrado motivos que pueden unirse a poli-ADP-ribosa con fuerza variable en más de 800 proteínas. Por lo tanto, la poli-ADP-ribosilación no solo cambia la estructura y la conformación de la proteína, sino que también puede atraer a otras proteínas [14] .
Las cadenas laterales de muchos aminoácidos pueden actuar como aceptores del grupo ADP-ribosa. Desde un punto de vista químico, la poli-ADP-ribosilación es una glicosilación : el ataque nucleofílico necesario para formar un enlace con la ribosa en la ADP-ribosa puede ser realizado por los átomos de oxígeno , nitrógeno o azufre de las cadenas laterales de los aminoácidos. [15] . Inicialmente, se creía que los objetivos de la glicosilación de ADP eran los residuos de glutamato y aspartato . Sin embargo, más tarde se demostró que la serina [16] [17] , la arginina [18] , la cisteína [19] , la lisina [20] , la diftamida [21] , la fosfoserina [22] y los residuos de asparagina también pueden someterse a ADP-ribosilación [23] .
Las PARP se activan durante el daño del ADN o el estrés celular, lo que aumenta la cantidad de poli-ADP-ribosa y disminuye la cantidad de NAD + [24] . Durante más de 10 años, se creyó que la única poli-ADP polimerasa en células de mamíferos es PARP1 , por lo tanto, de todas las poli-ADP polimerasas, esta enzima es la mejor estudiada. Durante la apoptosis, las caspasas activadas cortan PARP1 en dos fragmentos, inactivando completamente la enzima y limitando así la formación de poli-ADP-ribosa. Uno de los fragmentos resultantes pasa del núcleo al citoplasma y, como suele creerse, se convierte en un autoantígeno . En otra forma de muerte celular programada , la partanatosis , hay una acumulación de poli-ADP-ribosa provocada por la activación de PARP o la inactivación de la poli(ADP-ribosa) glicohidrolasa , una enzima que hidroliza poli- ADP-ribosa con la formación de ADP-ribosas libres. Durante la apoptosis, la poli-ADP-ribosa hace que las proteínas se muevan hacia el núcleo, lo que desencadena la fragmentación del ADN . La hiperactivación de PARP conduce a la muerte celular necrótica regulada por el factor de necrosis tumoral . Por un mecanismo aún no claro , los inhibidores de PARP afectan la necroptosis [25] .
La ribosilación de ADP puede influir en la expresión génica en casi todos los pasos, incluso a través de la organización de la cromatina , la unión del factor de transcripción y el procesamiento del ARNm . PARP1 puede influir en la estructura de la cromatina al introducir modificaciones postraduccionales en las colas de las histonas . Los PARP también pueden influir en la estructura de los factores de transcripción y sus interacciones entre sí y con los promotores . Por ejemplo, la mono-ADP-ribosiltransferasa PARP14 afecta la unión al promotor del factor de transcripción STAT . Otras ADP-ribosiltransferasas modifican proteínas que interactúan con el ARNm, lo que puede provocar el silenciamiento de los genes correspondientes [26] .
Los PARP pueden participar en la reparación de roturas de cadena simple y doble en el ADN. Por ejemplo, PARP1 se une al ADN en el sitio de una ruptura monocatenaria y comienza a sintetizar poli-ADP-ribosa, que interactúa con la proteína XRCC1 . Recluta en el sitio de ruptura otras proteínas involucradas en la reparación: polinucleótido quinasa , que procesa los extremos del ADN durante la reparación por escisión de base , y aprataxina , que está involucrada en la reparación de roturas de una sola hebra y unión de extremos no homólogos [27] .
PARP1 también participa en la reparación de roturas de doble cadena, por ejemplo, en la unión de extremos no homólogos. También es probable que ralentice el movimiento de la horquilla de replicación después del daño en el ADN y promueva la recombinación homóloga . Posiblemente, PARP1 esté involucrado en la reparación de roturas de doble cadena junto con PARP3 . Hay dos hipótesis sobre la naturaleza de su acción conjunta. Primero, pueden reemplazarse funcionalmente entre sí cuando se pierde la segunda poli-ADP-ribosiltransferasa. Según otra hipótesis, PARP3 lleva a cabo mono-ADP-ribosilación o sintetiza cadenas cortas a partir de residuos de poli-ADP-ribosa, y también activa PARP1, que las completa en cadenas largas [28] .
El principal mecanismo molecular de destrucción intracelular de proteínas defectuosas es la ubiquitina , el sistema de proteosomas . La tankirasa ADP-ribosiltransferasa (TNKS) interactúa con el regulador del proteasoma PI31 . Como se ha demostrado en Drosophila y células humanas , el dominio de anquirina de TNKS facilita la interacción con el motivo de unión N-terminal y el dominio C-terminal HbYX de la proteína PI31. Esta interacción promueve la ADP-ribosilación del dominio PI31 PARP de la tankirasa. Además, el tratamiento de las células de Drosophila con el inhibidor de TNKS conocido como XAV939 interrumpe la función de la subunidad 26S del proteasoma. Además, la PI31 poli-ADP-ribosilada ya no puede inhibir la actividad de las subunidades α de la subunidad del proteasoma 20S. Por lo tanto, la poli-ADP-ribosilación de PI31, mediada por tankirasa, afecta el funcionamiento del proteosoma [29] .
Como se discutió anteriormente, PARP1 está involucrado en la reparación de roturas de ADN de cadena simple y doble y también regula la apoptosis. Por esta razón, las células con actividad reducida de PARP1 son propensas a la malignidad . Muchos otros PARP también interfieren con la formación de células cancerosas. PARP2 participa en la reparación del ADN, PARP3 regula la duplicación del centrosoma y la tankirasa participa en la regulación de la longitud de los telómeros . Al mismo tiempo, la inhibición completa de PARP es uno de los enfoques utilizados actualmente en el tratamiento del cáncer , ya que las células privadas de al menos uno de PARP mueren rápidamente. Por ejemplo, la inhibición de PARP1 en células cancerosas provoca su muerte debido a múltiples daños en el ADN. PARP14 probablemente esté relacionado con el grado de agresividad de los linfomas de células B [5] .
Las exotoxinas ADP-ribosiladoras bacterianas llevan a cabo la unión covalente del residuo de ADP-ribosa con NAD + a la proteína del organismo eucariota infectado. Por ejemplo, la toxina del cólera y una de las enterotoxinas ADP-ribosilan la subunidad α de las proteínas G heterotriméricas . En el estado ADP-ribosilado, la subunidad α está constantemente activa y asociada con GTP , por lo tanto, el AMPc se sintetiza constantemente en la célula , lo que estimula la liberación de agua e iones de las células del epitelio intestinal . La toxina C3 de Clostridium botulinum ADP-ribosila las proteínas de unión a GTP Rho y Ras , la toxina pertussis también realiza la ADP-ribosilación de las proteínas G. En la difteria , el factor de elongación de la traducción EF-2 está ribosilado con ADP , lo que interfiere con la síntesis de proteínas [6] . Además de estas bacterias, las células de Pseudomonas aeruginosa ( exotoxina A ) secretan toxinas ADP-ribosiladoras [30] .