Los crioprotectores son sustancias que protegen a los objetos vivos de los efectos dañinos de la congelación. Los crioprotectores se utilizan en la crioconservación : almacenamiento a baja temperatura de objetos vivos (en otras palabras, al congelar cultivos celulares , sangre, esperma , embriones, órganos aislados y objetos biológicos completos).
La vitrificación tiene importantes aplicaciones para la conservación de embriones, tejidos biológicos y órganos para trasplante. La vitrificación también se utiliza en criónica. para reparar daños por heladas. Las propiedades crioprotectoras de estas sustancias consisten en bajar la temperatura de transición vítrea de un objeto congelado por debajo del punto de fusión. Así, los crioprotectores evitan la congelación efectiva y el sistema conserva cierta flexibilidad en la fase vítrea, comportándose como un sólido amorfo, que solidifica sin formar cristales que puedan dañar la muestra.
En el caso de las muestras biológicas, el daño no es causado principalmente por los cristales de hielo (dado que el interior de las células normalmente no se congela de esta manera, si es que lo hace), sino por cambios en la presión osmótica y la fuerza iónica (contenido de electrolitos de la célula). líquido). Al congelarse, los objetos vivos se ven afectados por dos factores dañinos: la formación de hielo intracelular y la deshidratación . La colocación de objetos vivos en soluciones de crioprotectores y la congelación en estas soluciones reduce o elimina por completo la formación de hielo intracelular y la deshidratación.
Muchos crioprotectores también funcionan formando enlaces de hidrógeno con moléculas biológicas al reemplazar las moléculas de agua. Los puentes de hidrógeno en soluciones acuosas son esenciales para el correcto funcionamiento de las proteínas y el ADN. Por lo tanto, cuando el crioprotector reemplaza las moléculas de agua, el material biológico conserva su estructura (y función) fisiológica natural, aunque ya no se sumerge en el medio acuático. Tal estrategia de conservación se ve muy a menudo en la anhidrobiosis .
Hay una gran cantidad de sustancias con propiedades crioprotectoras, pero en la práctica médica y de laboratorio no se utilizan más de una docena de compuestos, que se enumeran a continuación. Hay dos tipos de crioprotectores: penetrantes y no penetrantes.
Los crioprotectores funcionan aumentando la concentración de solutos en las células. Sin embargo, para ser biocompatibles, deben (1) penetrar fácilmente en las células y (2) no ser tóxicos para las propias células. Después de la descongelación, los objetos vivos deben liberarse de crioprotectores.
Los anticongelantes biológicos incluyen compuestos de bajo peso molecular y anticongelantes. Se encuentran, en particular, en organismos del clima ártico. Como compuestos de bajo peso molecular se utilizan glicerol , otros polioles , urea y glucosa , entre otros. Estos son compuestos que forman fácilmente enlaces de hidrógeno con moléculas de agua vecinas. Los compuestos que penetran en las membranas celulares evitan el crecimiento de cristales de hielo. Esto reduce la temperatura de congelación dentro de las células. En algunos casos, la concentración de agua en las células también disminuye ( anhidrobiosis ).
La mayoría de las proteínas anticongelantes no evitan que el plasma celular se congele, pero pueden retrasarlo ligeramente. Su acción se basa en que inhiben el crecimiento de los cristales de hielo y protegen los cristales de hielo ya formados, que pueden actuar como núcleos de cristalización . Como resultado, los cristales resultantes siguen siendo pequeños, el hielo se vuelve de grano fino y no puede destruir las estructuras celulares, incluso si se congela. Después de la descongelación , la célula reanuda sus funciones normales.
Las proteínas anticongelantes (AFP) pertenecen a una clase de polipéptidos producidos por ciertos vertebrados, plantas, hongos y bacterias que les permiten sobrevivir en ambientes negativos. Estas proteínas se unen a pequeños cristales de hielo e impiden su crecimiento y recristalización, que de otro modo sería fatal. También hay una creciente evidencia de que las AFP interactúan con las membranas celulares de las células de los mamíferos para protegerlas del daño por frío.
Las proteínas anticongelantes no bajan el punto de congelación en proporción a la concentración. Más bien, funcionan de forma no coligativa [1] . Esto les permite actuar como anticongelante en concentraciones de 1/300 a 1/500 de otros solutos, con la consiguiente minimización de su efecto sobre la presión osmótica. Estas habilidades inusuales se atribuyen a su capacidad para unirse a ciertas superficies de cristales de hielo.
Las proteínas anticongelantes crean una diferencia entre el punto de fusión del hielo y el punto de congelación del agua, lo que se conoce como histéresis térmica . La adición de proteínas AFP en la interfaz entre el hielo y el agua líquida inhibe el crecimiento termodinámicamente favorable de los cristales de hielo. El crecimiento de cristales es inhibido cinéticamente por AFP, que recubre las superficies de los cristales de hielo accesibles al agua.
Los crioprotectores más comunes en la industria son varios glicoles, es decir, polihidroxoalcoholes ( etilenglicol , propilenglicol , glicerol ). El etilenglicol es un ingrediente en los líquidos de los radiadores de los automóviles en invierno, y el propilenglicol a veces se usa para reducir la cantidad de cristales de hielo en el helado y producir una textura más suave. Otro crioprotector popular es el dimetilsulfóxido junto con el glicerol, comúnmente utilizado para proteger muestras biológicas (espermatozoides, embriones) durante su almacenamiento en nitrógeno líquido.
Para aumentar la efectividad de los crioprotectores y mitigar los efectos secundarios de su uso, sus mezclas se usan con mayor frecuencia. Una mezcla de formamida con dimetilsulfóxido, propilenglicol y el coloide correspondiente ha sido durante mucho tiempo el crioprotector creado artificialmente más efectivo.
La vitrificación es ampliamente utilizada como método para la crioconservación de embriones y ovocitos . Dicha transición vítrea se consigue mediante un enfriamiento muy rápido, que utiliza una solución muy concentrada que no cristaliza al congelarse, de manera que su viscosidad aumenta al disminuir la temperatura hasta formar un sólido amorfo. La tasa de disminución de la temperatura alcanza los 23000°C/min. Para lograr un gran cambio de temperatura a alta velocidad, se utiliza un volumen medio mínimo (menos de 0,1 microlitros) y nitrógeno líquido a -196 ° C. La exposición y la velocidad de congelación deben ser lo suficientemente altas para evitar la toxicidad y la formación de residuos intracelulares. cristales que pueden dañar las celdas del contenido. Para conseguir una deshidratación muy rápida se utilizan crioprotectores en altas concentraciones. La velocidad de congelación/descongelación es indirectamente proporcional a la concentración de crioprotectores. Antes de la congelación, el material biológico debe equilibrarse con esta solución crioprotectora (a menor concentración) para que resista el choque osmótico. Las tasas de supervivencia de las muestras superan el 90 % y los embriones suelen sobrevivir intactos.
Una vez que se ajusta la vitrificación en el laboratorio, las tasas de supervivencia superan el 90 %, independientemente del tipo de muestra. Los embriones suelen sobrevivir intactos (100% blastómeros). Este método es útil tanto para embriones como para ovocitos, pero no para espermatozoides. Se requiere una velocidad extrema durante el proceso de desvitrificación (descongelación), retirando la muestra del nitrógeno líquido e introduciéndola en el medio a 37 ° C. Algunos estudios enfatizan que esta velocidad de descongelación puede ser más importante que la velocidad de congelación para lograr altas tasas de supervivencia de ovocitos criopreservados.
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