Reacción en cadena de la polimerasa anidada

La reacción en cadena de la polimerasa anidada ( PCR anidada en inglés -  PCR  "anidada") es una variación de dos etapas de la PCR que se usa para reducir la cantidad de productos de reacción no específicos [1] . En la primera etapa , se amplifica una región , que incluye el fragmento de ADN diana y sus secuencias flanqueantes (es decir, ubicadas en los bordes del fragmento), a la que se hibrida el primer par de cebadores . En el segundo paso, se agregan cebadores que son complementarios .extremos del fragmento objetivo. Dado que el producto de la primera etapa contiene el fragmento objetivo (es decir, el producto final dentro del producto de la primera etapa), esta variación de PCR se denomina anidada [1] .

Reacción en cadena de la polimerasa

La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un proceso de amplificación de ADN que utiliza la enzima ADN polimerasa dependiente de ADN . Tal reacción ha encontrado una amplia aplicación en los laboratorios genéticos para detectar la presencia de una determinada sección de ADN o ARN en las muestras (en el segundo caso, es necesario convertir primero el ARN en ADN mediante una reacción de transcripción inversa ). Además, la PCR se utiliza en ingeniería genética para obtener el fragmento necesario y su posterior uso en clonación , transcripción in vitro y otros fines. Un paso importante en la preparación de la reacción es la elección de los cebadores que se aparearán en los extremos del fragmento objetivo. En este caso, los cebadores a menudo también se hibridan con otras regiones del ADN, lo que da como resultado una mezcla de productos. La probabilidad de que esto suceda aumenta con el número de ciclos de PCR [1] .

Imprimadores

La PCR anidada utiliza dos pares de cebadores agregados en dos pasos de reacción consecutivos. El primer par se denomina externo y sirve para la amplificación inicial del sitio, que incluye el fragmento de ADN diana, mientras que en esta etapa se utiliza un pequeño número de ciclos de temperatura (de 15 a 30). El segundo par, llamado interno, se recoce al producto del primero y se utiliza en la segunda etapa de PCR con una gran cantidad de ciclos de temperatura. Dado que la cantidad de ADN que contiene el fragmento objetivo aumenta exponencialmente después del primer paso , y los cebadores utilizados en cada paso son complementarios a diferentes secuencias alrededor de la región de ADN objetivo, la especificidad resultante de la reacción aumenta. Este enfoque se utiliza a menudo para obtener fragmentos raros o regiones de baja complejidad (por ejemplo, secuencias ricas en GC ) [2] .

Pasos de reacción y protocolo

El protocolo de PCR anidado fue descrito por primera vez en 1993 por Kamolvarin y colaboradores para el diagnóstico de la rabia [3] . Desde entonces, la secuencia de acciones se ha mantenido prácticamente sin cambios [4] . El protocolo original del artículo se describe a continuación.

Primera etapa

Después del aislamiento del ARN, se realizó la transcripción inversa usando 50 pmol de cada par de cebadores externos para 1 μg de material. A continuación, la mezcla que contenía la fusión de ARN/ ADNc y los cebadores se completó hasta 50 µl con un tampón de PCR que contenía 1,25 U. Taq-DNA polimerasa y 62,5 µmol/l de dDNP ( desoxirribonucleósido trifosfato ). Se colocaron 50 µl de aceite mineral sobre la mezcla y se realizaron 30 ciclos de PCR (94 °C, 1 min (fusión); 45 °C, 2 min (recocido); 72 °C, 2,5 min (elongación)) [ 3] .

En el primer paso, se utiliza un par externo de cebadores complementarios a las regiones alrededor del fragmento de ADN objetivo para amplificar este fragmento. Además del sitio objetivo, los cebadores también pueden hibridarse con otros sitios. La mezcla final de productos de la primera etapa incluye tanto el ADN diana como las impurezas [3] .

Segunda etapa

Para la segunda etapa de la PCR anidada, se tomó una alícuota de 2 µl de la primera mezcla y se añadió a 23 µl de una mezcla que contenía 20 pmol de cebadores internos complementarios a las regiones del propio fragmento diana, 25 mmol/l de dDNF y 1 unidad de ADN polimerasa Taq. Pasaron 30 ciclos de amplificación con el mismo programa que en la primera etapa [3] .

En este caso, la probabilidad de hibridación del cebador con otros productos de la primera etapa es extremadamente baja y, en la mayoría de los casos, solo se amplifica el fragmento de ADN diana [2] [3] .

Ejemplos de uso

La PCR anidada se usa ampliamente en tareas que requieren una alta especificidad, como: sistemas de prueba [5] , trabajo con pequeñas cantidades de material [6] , purificación de muestras de ADN para su posterior análisis y uso [7] .

Casos de uso específicos para PCR anidada:

Notas

  1. ↑ 1 2 3 Shen Chang-Hui. Amplificación de Ácidos Nucleicos  (Inglés)  // Biología Molecular Diagnóstica. - 2019. - Pág. 215-247 . — ISBN 9780128028230 . -doi : 10.1016 / B978-0-12-802823-0.00009-2 .
  2. ↑ 1 2 Haff LA. PCR cuantitativa mejorada usando cebadores anidados.  (inglés)  // Investigación del genoma. - 1994. - 1 de junio ( vol. 3 , no. 6 ). - Pág. 332-337 . — ISSN 1088-9051 . -doi : 10.1101/ gr.3.6.332 .
  3. ↑ 1 2 3 4 5 Kamolvarin N. , Tirawatnpong T. , Rattanasiwamoke R. , Tirawatnpong S. , Panpanich T. , Hemachudha T. Diagnosis of Rabies by Polymerase Chain Reaction with Nested Primers  //  Journal of Infectious Diseases. - 1993. - 1 de enero ( vol. 167 , n. 1 ). - pág. 207-210 . — ISSN 0022-1899 . -doi : 10.1093 / infdis/167.1.207 .
  4. ↑ Pelt-Verkuil, Elizabeth van, 1951-. Principios y aspectos técnicos de la amplificación por PCR . - [Dordrecht]: Springer, 2008. - 1 recurso en línea (325 páginas) p. - ISBN 978-1-4020-6241-4 , 1-4020-6241-9 , 978-1-4020-6240-7 281-24237-2.
  5. ↑ 1 2 Sun Yajuan , Chen Jiajun , Li Jia , Xu Yawei , Jin Hui , Xu Na , Yin Rui , Hu Guohua. Nuevo enfoque basado en la PCR anidada de un tubo y una tira de flujo lateral para el diagnóstico altamente sensible de la meningitis tuberculosa  //  PLOS ONE. - 2017. - 30 de octubre ( vol. 12 , no. 10 ). — P.e0186985 . — ISSN 1932-6203 . - doi : 10.1371/journal.pone.0186985 .
  6. ↑ 1 2 Gallego Sandra , Mangano Andrea , Gastaldello René , Sen Luisa , Medeot Silvia. Utilidad de una reacción en cadena de la polimerasa anidada para el diagnóstico molecular del virus linfotrópico de células T humanas tipo I/II  //  Memorias del Instituto Oswaldo Cruz. - 2004. - junio ( vol. 99 , no. 4 ). - P. 377-380 . — ISSN 0074-0276 . -doi : 10.1590 / S0074-02762004000400006 .
  7. ↑ 1 2 Mamedov Ilgar Z. , Britanova Olga V. , Zvyagin Ivan V. , Turchaninova Maria A. , Bolotin Dmitriy A. , Putintseva Ekaterina V. , Lebedev Yuriy B. , Chudakov Dmitriy M. Preparación del receptor de células T y el anticuerpo imparciales Bibliotecas de cDNA para el perfilado profundo de secuenciación de próxima generación  //  Frontiers in Immunology. - 2013. - Vol. 4 . — ISSN 1664-3224 . -doi : 10.3389/ fimmu.2013.00456 .
  8. ↑ Llop Pablo , Bonaterra Anna , Peñalver Javier , López María M. Desarrollo de un procedimiento de PCR anidada de alta sensibilidad utilizando un único tubo cerrado para la detección de material vegetal asintomático de Erwinia amylovorain  //  Microbiología aplicada y ambiental. - 2000. - 1 de mayo ( vol. 66 , n. 5 ). - Pág. 2071-2078 . — ISSN 1098-5336 . -doi : 10.1128/ AEM.66.5.2071-2078.2000 .
  9. ↑ Yang Xue , Hameed Uzma , Zhang Ai-Fang , Zang Hao-Yu , Gu Chun-Yan , Chen Yu , Xu Yi-Liu. Desarrollo de un ensayo de PCR anidado para la detección rápida de Pilidiella granati en frutos de granada  //  Scientific Reports. - 2017. - 20 de enero ( vol. 7 , no. 1 ). — ISSN 2045-2322 . -doi : 10.1038/ srep40954 .
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  11. ↑ Lin Chao , Ying Furong , Lai Yanan , Li Xiaolong , Xue Xiangyang , Zhou Tieli , Hu Dongwei. Uso de PCR anidada para la detección de tricomonas en líquido de lavado broncoalveolar  (inglés)  // BMC Infectious Diseases. - 2019. - 10 de junio ( vol. 19 , no. 1 ). — ISSN 1471-2334 . -doi : 10.1186/ s12879-019-4118-9 .
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