Anti-CRISPR ( en inglés Anti-CRISPR ) es un sistema proteico , gracias al cual los bacteriófagos (tanto bacterias como arqueas ) resisten la acción destructiva de los sistemas CRISPR /Cas. Se han descrito sistemas anti-CRISPR en muchos bacteriófagos. Las proteínas de estos sistemas en la mayoría de los casos interfieren con el proceso de reconocimiento de objetivos y el trabajo de las proteínas Cas. Los sistemas anti-CRISPR pueden tener importancia biotecnológica , ya que se pueden utilizar para ajustar la edición del genoma mediante la tecnología CRISPR/ Cas9 .
Antes del descubrimiento de anti-CRISPR, la única forma conocida de evitar que los fagos fueran destruidos por el sistema CRISPR/Cas era mediante la adquisición de mutaciones puntuales . Prácticamente no afectan la viabilidad del fago, pero rompen la complementariedad del apareamiento del ADN del fago con el ARN guía , por lo que el sistema CRISPR/Cas no puede reconocer el material genético viral . Sin embargo, los microorganismos encuentran rápidamente una manera de eludir esta protección insertando nuevos fragmentos de ADN extraño en su genoma . Las primeras proteínas anti-CRISPR se descubrieron en 2013 en varios fagos relacionados que atacan a la bacteria Pseudomonas aeruginosa . Teóricamente, si un fago se integra en el genoma de una bacteria que tiene un sistema CRISPR/Cas activo, la bacteria morirá porque corta su propio genoma. Sin embargo, la inserción de algunos fagos en el genoma de bacterias con CRISPR/Cas activo no condujo a la muerte celular. Al comparar los genomas de los fagos que causan la muerte de las células bacterianas y los fagos que no conducen a la muerte celular, resultó que estos últimos tienen un locus especial que contiene diez genes completamente diferentes y muy cortos (150-450 nucleótidos de largo ). Resultó que los productos proteicos de cinco de ellos (acrF1-acrF5) interrumpen el sistema CRISPR/Cas de tipo IF en P. aeruginosa , y cuatro más (acrE1-acrE4) bloquean el sistema de tipo IE en la misma bacteria. Se han identificado genes anti-CRISPR no solo en fagos de P. aeruginosa , sino también en plásmidos e islotes conjugativos de esta bacteria [1] .
Las secuencias de aminoácidos de las proteínas anti-CRISPR varían mucho y carecen de un motivo común que ayudaría a identificar genes similares en los genomas de otros bacteriófagos utilizando métodos bioinformáticos estándar . Sin embargo, resultó que el entorno de los genes anti-CRISPR es muy similar: después de los propios genes anti-CRISPR, todos ellos tienen un gen que codifica el factor de transcripción Aca1 ( anti-CRISPR asociado 1 ) [1] . Los fagos que carecen de genes anti-CRISPR también carecen del gen aca1 . Además, los genes anti-CRISPR y el gen aca1 forman un solo operón , y la proteína Aca1 parece regular la expresión anti-CRISPR según la etapa del ciclo de infección del fago . La proteína Aca1 tiene un motivo estructural hélice-giro-hélice , que a menudo se encuentra entre los factores de transcripción. Para establecer si la región estudiada del genoma del bacteriófago codifica proteínas anti-CRISPR, los científicos verificaron la presencia inmediatamente después de un gen que codifica una proteína con el motivo "hélice-giro-hélice". Usando este enfoque, se han descubierto proteínas anti-CRISPR que actúan contra los sistemas de tipo I en bacteriófagos de una variedad de proteobacterias . El mismo enfoque condujo al descubrimiento de sistemas disruptivos de tipo II anti-CRISPR [1] [2] .
Recientemente, se ha creado una base de datos de proteínas anti-CRISPR, antiCRISPRdb, en la que cualquiera puede encontrar información conocida sobre una proteína anti-CRISPR de interés [3] .
Hoy se conocen 22 familias de proteínas anti-CRISPR . Están unidos únicamente por su pequeño tamaño (de 50 a 150 residuos de aminoácidos), no tienen ningún motivo común y ninguno de ellos se parece a ninguna proteína con una función conocida. Por lo tanto, resultó imposible sugerir el mecanismo de acción de anti-CRISPR usando bioinformática. Hasta el momento, ha sido posible establecer el mecanismo de acción de seis proteínas anti-CRISPR utilizando enfoques genéticos , bioquímicos y estructurales. En teoría, las proteínas anti-CRISPR pueden influir en el funcionamiento de CRISPR/Cas en varias etapas [1] . Ellos pueden:
De momento se ha descrito la acción de las proteínas anti-CRISPR en los dos últimos escenarios. Por ejemplo, las proteínas AcrF1 y AcrF2 se unen al complejo de proteínas Cas y ARN, evitando que se una a ADN extraño. La proteína AcrF3 interactúa con la proteína Cas3, que tiene actividades de helicasa y nucleasa , y evita que se una al complejo de otras proteínas Cas y ARN que ya se ha unido al ADN diana. AcrIIC1 se une al dominio nucleasa de la proteína Cas9 (la única proteína Cas en los sistemas de tipo II), evitando que corte el ADN [1] .
Algunas proteínas anti-CRISPR son activas contra múltiples sistemas CRISPR/Cas. Por ejemplo, las proteínas anti-CRISPR que actúan contra los sistemas de tipo II-A suprimen la función de las proteínas Cas9 homólogas , cuyas secuencias de aminoácidos son solo un 53 % similares [1] [2] .
Estudios recientes han demostrado que las mutaciones puntuales por sí solas no son suficientes para que los bacteriófagos escapen a la acción de CRISPR/Cas. El fago debe tener al menos un gen anti-CRISPR para evitar que se elimine por completo cuando se cultiva conjuntamente con bacterias con sistemas CRISPR/Cas activos. Aparentemente, una selección tan fuerte contribuye a la diversidad de secuencias de aminoácidos y mecanismos de acción de anti-CRISPR. Las proteínas anti-CRISPR sirven como factores importantes en la evolución de los microorganismos. Así, la inserción de elementos genéticos móviles con los genes de tales proteínas en el genoma bacteriano conduce a la inactivación permanente de los sistemas CRISPR/Cas debido a la expresión estable de anti-CRISPR. Una célula en este estado no puede resistir la entrada de otros elementos genéticos transponibles y por lo tanto la transferencia horizontal de genes . Con la inactivación a largo plazo de CRISPR/Cas, una bacteria puede perder por completo los genes cas o acumular mutaciones que los hacen no funcionales. El análisis bioinformático de los sistemas CRISPR/Cas de varias bacterias mostró que alrededor del 12% de ellas no son funcionales debido a la pérdida de genes cas o mutaciones dañinas en ellos. Se ha demostrado experimentalmente que, en condiciones en las que la adquisición de ADN extraño es beneficiosa, las bacterias pueden perder por completo el sistema CRISPR/Cas [2] .
Por el momento, se conocen proteínas anti-CRISPR que suprimen la actividad de Cas9 de la bacteria Streptococcus pyogenes (esta enzima se usa con mayor frecuencia para editar genomas usando sistemas CRISPR/Cas). Es más, dos de ellos lo hacen en células humanas , bloqueando la edición del genoma. Por lo tanto, las proteínas anti-CRISPR pueden regular la edición del genoma por CRISPR/Cas, por ejemplo, dejando el sistema activo solo en ciertos tejidos y órganos , solo en ciertas etapas del desarrollo embrionario, o solo en ciertos momentos del ciclo celular . Además, el uso de anti-CRISPR ayudará a reducir la frecuencia de mutaciones no programadas introducidas por Cas9. Por lo general, Cas9 está activo hasta que la célula destruye la enzima o el ARN guía, y un período demasiado prolongado de actividad de Cas9 a menudo da como resultado mutaciones fuera del gen objetivo. Muchos patógenos bacterianos humanos tienen sistemas CRISPR/Cas activos, y el uso de proteínas anti-CRISPR puede aumentar significativamente la eficacia de la terapia con fagos . Por lo tanto, las proteínas anti-CRISPR pueden encontrar una amplia aplicación en biotecnología, ingeniería genética y medicina en el futuro [1] .