CRISPR

CRISPR (del inglés  , repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas  - repeticiones palindrómicas cortas dispuestas regularmente en grupos [1] ) son loci especiales de bacterias y arqueas [2] que consisten en secuencias repetitivas directas que están separadas por secuencias únicas ( espaciadores ). Los espaciadores se toman prestados de elementos genéticos extraños que encuentra la célula ( bacteriófagos , plásmidos ). ARN transcrito _de los loci CRISPR, junto con las proteínas Cas asociadas, proporcionan inmunidad adaptativa debido a la unión complementaria del ARN a los ácidos nucleicos de elementos extraños y su posterior destrucción por las proteínas Cas. Sin embargo, hasta la fecha, hay mucha evidencia de la participación de CRISPR en procesos no relacionados con la inmunidad .

El uso de métodos CRISPR-Cas para la edición dirigida del genoma es una dirección prometedora en la ingeniería genética moderna . Para 2016, los científicos utilizan ampliamente enfoques basados ​​en sistemas CRISPR-Cas; quizás en el futuro estos enfoques se utilicen en medicina para el tratamiento de enfermedades hereditarias [3] .

Además, CRISPR-Cas es importante para la administración dirigida de fármacos y su liberación bajo influencia externa; para esto, se utilizan materiales que incluyen secciones de ADN [4] .

Historia del estudio

El primer locus CRISPR fue descubierto en la bacteria Escherichia coli en 1987 por un grupo de científicos japoneses liderados por Yoshizumi Isino . Notaron elementos repetidos en el genoma de esta bacteria, separados por secuencias no repetidas ( espaciadores ) [5] ; sin embargo, los científicos no le dieron mucha importancia a su observación. Un estudio a gran escala de CRISPR fue iniciado por el investigador español Francisco Mojica , quien en 1993 descubrió secuencias repetidas separadas por brechas en el genoma de la arquea Haloferax mediterranei . Se dio cuenta de que las repeticiones en los genomas de esta arquea y E. coli son muy similares en estructura, pero no tienen nada en común en las secuencias de nucleótidos . Según Mojic, las repeticiones tan similares en estructura, que son sistemáticamente grupos de procariotas muy distantes , deben realizar alguna función muy importante. Inicialmente, denominó a la nueva clase de repeticiones “repeticiones cortas regularmente espaciadas, SRSR ”  , pero más tarde, por sugerencia suya, este nombre se cambió a “repeticiones palindrómicas cortas regularmente dispuestas en grupos” (en inglés , Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats, CRISPR ) . Mojica continuó buscando CRISPR en los genomas de otros microbios, y para el año 2000 los había encontrado en 20 microorganismos, incluido el bacilo de la peste Yersinia pestis y otros patógenos [6] . En 2002, se descubrieron los genes cas  , los genes de los loci CRISPR que codifican las proteínas Cas [7] .  

A pesar del descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas en una amplia variedad de procariotas, poco se sabía sobre las funciones de CRISPR hasta 2005. En 2005, Mojica y sus colegas publicaron [8] los resultados de sus nuevos estudios, en los que se encontró que los espaciadores corresponden a secuencias de genomas de bacteriófagos, así como a regiones de plásmidos. También encontraron que las cepas de E. coli cuyos loci CRISPR contienen un espaciador correspondiente al fago P1 son ​​resistentes a este fago y concluyeron que los loci CRISPR están asociados con la inmunidad adaptativa de los procariotas. En el mismo año aparecieron publicaciones [9] [10] de dos grupos de investigación más, que llegaban a la misma conclusión [6] .

En 2006, se desarrolló una clasificación de CRISPR conocidos y se propuso un posible mecanismo para la inmunidad adaptativa basada en CRISPR [11] . En 2007, un grupo de investigación dirigido por Philipp Horvath finalmente estableció y probó experimentalmente [6] la participación de CRISPR para garantizar el trabajo de inmunidad adaptativa específica para secuencias objetivo; al mismo tiempo, se reveló el papel clave de las proteínas Cas en este proceso [12] . Por este logro, en 2015 fue galardonado con el Premio Massry junto con otros científicos que han hecho una contribución significativa al estudio de CRISPR ( Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier ) [13] .  En 2008, se demostró que el sistema CRISPR requiere ARN CRISPR especialmente procesado (ARNcr) para funcionar, y también se demostró la capacidad del sistema CRISPR para realizar interferencias de ADN . La interferencia, la selección de ARN y la selección de secuencias de ADN específicas son tres descubrimientos en 2007-2008 que iniciaron el desarrollo de métodos de ingeniería genética basados ​​en CRISPR [14] .

Una serie de importantes descubrimientos posteriores relacionados con el diseño de sistemas CRISPR tipo II (en particular, la necesidad de la proteína Cas9 y un pequeño ARN adicional, llamado tracrRNA, además de crRNA), hicieron posible en 2012 probar experimentalmente el primer desarrolló el sistema CRISPR tipo II. A principios de 2013 (alrededor de dos semanas), varios grupos demostraron que los sistemas CRISPR-Cas artificiales pueden funcionar no solo en células bacterianas e in vitro , sino también en células eucariotas [14] .

Los siguientes dos años y medio vieron el desarrollo de métodos CRISPR y la aplicación de este método en varios grupos de organismos . En abril de 2015, un grupo de científicos de China publicó los resultados de su estudio, en el que se editaron genomas de embriones humanos utilizando CRISPR-Cas9 [15] . Sin embargo, la precisión de la edición en este experimento fue muy baja [15] y el experimento en sí fue percibido de manera ambigua por la comunidad científica [16] . A principios de 2016, científicos de EE. UU. informaron que pudieron reducir la cantidad de errores durante la operación de CRISPR-Cas9 a casi cero [17] . Hasta la fecha, CRISPR se considera la innovación tecnológica más importante en las ciencias de la vida desde la invención de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), descubierta tres décadas antes [14] . Por la introducción de técnicas de edición de genes utilizando CRISPR-Cas9, Jennifer Doudna y Emmanuelle Charpentier recibieron el Premio Nobel de Química 2020 [18] .

En 2016, un grupo de científicos descubrió que los sistemas CRISPR-Cas se originaron a partir de transposones que perdieron su movilidad y se fijaron en el genoma [19] [20] . Un estudio filogenético ha demostrado que todas las endonucleasas Cas descienden de un solo transposón de todos los transposones que llevan la endonucleasa IscB [19] .

Principios generales

Los sistemas CRISPR-Cas difieren tanto estructural como funcionalmente. Sin embargo, todos los sistemas CRISPR-Cas tienen una serie de características comunes [14] .

Los loci CRISPR pueden realizar la función de inmunidad solo en presencia de genes cas , que generalmente se encuentran muy cerca de CRISPR. El conjunto de genes cas determina el tipo de sistema CRISPR-Cas. Los loci CRISPR son repeticiones directas cortas (generalmente de unos 30 a 40 nucleótidos de largo) que están separadas entre sí por espaciadores no repetitivos derivados del ADN de los elementos genéticos extraños encontrados por la célula o sus precursores. La longitud de los espaciadores suele ser comparable a la longitud de las repeticiones. Antes de un número de repeticiones y espaciadores, hay una secuencia líder que contiene, por regla general, un promotor , a partir del cual comienza la transcripción unidireccional de repeticiones y espaciadores CRISPR. Los espaciadores están totalmente integrados en el genoma celular y se transfieren a sus descendientes durante la división [14] . En las bacterias, la integración de nuevos espaciadores en el genoma se combina con la pérdida de genes extraños y redundantes; por lo tanto, las bacterias logran evitar un aumento significativo en el tamaño del genoma, a diferencia de los eucariotas superiores , en los que las secuencias repetidas derivadas de elementos genéticos exógenos constituyen una parte esencial del genoma [21] .

Además de la similitud estructural, varios sistemas CRISPR-Cas combinan tres etapas clave de la inmunidad mediada por CRISPR: adquisición ( adquisición en inglés  ) o adaptación ( adaptación en inglés ) [21] , expresión ( expresión en inglés ) e interferencia ( interferencia en inglés ). En la etapa de adquisición, se inserta un nuevo espaciador en CRISPR, formado a partir de un elemento genético extraño que ha ingresado a la célula. En la etapa de expresión, se lleva a cabo la transcripción CRISPR y el procesamiento de ARN CRISPR cortos (ARNcr) dirigidos a un objetivo específico. Durante la interferencia, el complejo de ribonucleoproteína Cas-ARNcr reconoce el ácido nucleico diana debido al emparejamiento de bases complementarias de la diana con el ARNcr, después de lo cual corta la diana debido a la actividad endonucleasa y/o exonucleasa de las proteínas Cas [14] [22] .    

Curiosamente, el trabajo de los sistemas CRISPR-Cas tiene muchos puntos fundamentales en común con el trabajo del sistema inmunitario de los mamíferos . Por lo tanto, incluso un bacteriófago defectuoso puede provocar la inmunización CRISPR (es decir, la inserción de un nuevo espaciador), al igual que la respuesta inmunitaria de los mamíferos puede desarrollarse cuando se introduce un patógeno muerto [21] .

Los sistemas CRISPR-Cas se pueden transferir de un microorganismo a otro mediante la transferencia horizontal de genes . Contrarrestar la invasión de elementos genéticos extraños en una bacteria no siempre es beneficioso para la bacteria. Por ejemplo, la bacteria Staphylococcus epidermidis puede experimentar una disminución de la resistencia a los antibióticos debido a la destrucción por parte del sistema CRISPR-Cas de aquellos plásmidos conjugativos que proporcionaron esta resistencia. En Staphylococcus aureus , un número reducido de loci CRISPR conduce a un aumento en el número de profagos , plásmidos y elementos genéticos transponibles en la célula, lo que aumenta la virulencia de la bacteria. Sin embargo, los loci CRISPR-Cas, que impiden la propagación de elementos genéticos móviles útiles en determinadas condiciones, pueden desaparecer [21] [23] .

Compra de espaciadores

Debido a que la inmunidad adaptativa mediada por CRISPR está codificada en el ADN, el proceso de inmunización implica copiar e insertar elementos genéticos extraños en CRISPR como nuevos espaciadores. Los espaciadores constituyen la memoria inmunológica, que almacena información sobre infecciones pasadas , y es esto lo que subyace a la respuesta a la invasión repetida de elementos genéticos similares. La mayor parte de los datos sobre los mecanismos moleculares de adquisición de nuevos espaciadores se obtuvieron estudiando el sistema CRISPR de Escherichia coli tipo I y Streptococcus thermophilus tipo II . La correcta orientación e inserción de un nuevo espaciador ocurre con la participación de la secuencia inmediatamente anterior a la primera repetición; por lo tanto, se agregan nuevos espaciadores al extremo 5' del locus CRISPR. La integración del nuevo espaciador entre la secuencia líder y la primera repetición la realiza el complejo Cas1-Cas2-protospacer. En algunos sistemas CRISPR-Cas, hay proteínas adicionales involucradas en este proceso. Cuando se inserta un nuevo espaciador, se produce una duplicación de la repetición, por lo que se conserva la estructura correcta del locus, que debe comenzar con una repetición [14] [24] .

Dado que los espaciadores se transmiten de antepasados ​​a descendientes durante la división celular, en presencia de espaciadores similares, se pueden establecer relaciones filogenéticas entre cepas que tienen espaciadores ancestrales comunes, así como cepas que tienen espaciadores nuevos adquiridos recientemente [14] .

En los sistemas de tipo I y II, la inserción del espaciador puede ocurrir solo a partir de aquellos elementos extraños en los que una secuencia PAM especial ( motivo adyacente al protoespaciador) es   adyacente al protoespaciador [24] . Además, la bacteria debe distinguir el material genético extraño del propio para no insertar un fragmento de su propio cromosoma como espaciador y no dirigir el sistema CRISPR-Cas a su genoma, lo que sería fatal para la célula. El sistema CRISPR-Cas de E. coli tipo I distingue su ADN por la presencia de sitios Chi , motivos  de 8 nucleótidos que se repiten en su genoma en promedio cada 5 mil pares de bases [25] . Aunque se pueden formar muchos espaciadores a partir de un mismo elemento genético extraño, en un elemento genético algunos motivos resultan más preferibles a la hora de elegir un futuro espaciador. Probablemente, tales motivos fueron fijados como resultado de la selección natural asociada con la eficiencia de los espaciadores; por ejemplo, algunos espaciadores dan lugar a crRNA que dirigen proteínas Cas a secuencias parcialmente complementarias [14] .

Cuando se enfrentan al mismo fago, diferentes células insertarán fragmentos ligeramente diferentes de su genoma como espaciador, de modo que grandes poblaciones que tienen una gran variedad de espaciadores contra el mismo fago ofrecen una resistencia más efectiva: si el fago muta de modo que uno de los existentes espaciadores en la población se vuelven ineficaces, otros seguirán brindando protección [26] .

Expresión y formación de crRNA

Después de la integración en CRISPR de partes de elementos genéticos extraños, se requiere transformarlos en una forma capaz de dirigir proteínas Cas a secuencias objetivo para su reconocimiento y destrucción. Esta forma es la guía crRNA, que contiene una secuencia única que es complementaria a un objetivo específico. En primer lugar, se transcriben varias repeticiones y espaciadores de CRISPR en un solo transcrito largo, pre-ARNcr, que luego se corta en ARNcr cortos. La mayoría de las repeticiones en CRISPR son palíndromos , por lo que sus regiones pre-crRNA correspondientes forman horquillas . En muchos casos, son estas horquillas las que son reconocidas por las proteínas Cas que procesan el pre-ARNcr en ARNcr [14] .

Por lo general, la transcripción CRISPR depende de la secuencia líder y se produce de forma continua pero a un ritmo lento. Sin embargo, la tasa aumenta significativamente en condiciones de estrés o cuando la célula choca con los fagos, brindándole una protección rápida y efectiva. Los elementos promotores se encontraron no solo en la secuencia líder, sino también en las repeticiones. Aunque un locus completo se puede transcribir a la vez, se ha demostrado que algunos espaciadores en un locus se transcriben con más frecuencia que otros, como los primeros espaciadores que siguen a la secuencia líder y la primera repetición. De hecho, es mucho más ventajoso para una célula tener una defensa más fuerte contra los elementos invasivos que ha encontrado en el pasado reciente que contra los que ha encontrado hace mucho tiempo [14] .

Interferencia

En la etapa de interferencia, los crRNA se unen a sus objetivos mediante el emparejamiento de bases y, por lo tanto, dirigen a las endonucleasas Cas para cortar y destruir el objetivo. La formación de un complejo de crRNA y proteínas Cas proporciona la destrucción endonucleolítica de secuencias complementarias de crRNA NA. Aunque los objetivos son principalmente ADN de doble cadena (dsDNA), algunos sistemas CRISPR-Cas pueden degradar ARN complementarios de una sola cadena (ssRNA). Los sistemas CRISPR-Cas que reconocen dsDNA son exigentes con respecto a las secuencias adyacentes al protospacer: en particular, en los sistemas de tipo I y II, solo se reconocen los objetivos que contienen el motivo PAM (el requisito de la presencia de PAM puede servir para proteger contra el corte el genoma celular por el sistema CRISPR-Cas) . Los sistemas que funcionan con ssRNA no tienen tales requisitos. Después del ataque endonucleolítico inicial (rompiendo el objetivo) por Cas, puede ocurrir una mayor destrucción del objetivo bajo la acción de otras nucleasas [14] .

Variedad de sistemas CRISPR-Cas

Todos los sistemas CRISPR-Cas conocidos se pueden dividir en dos clases principales, 5 tipos y 16 subtipos, según la presencia o ausencia de ciertos genes cas , la estructura del operón cas , las secuencias de aminoácidos de las proteínas Cas y los mecanismos que garantizar el funcionamiento de la inmunidad mediada por CRISPR [27] [28] .

Además, existe el sistema CRISPR-Rx (CRISPR-CasRx), que se dirige al ARN (a diferencia de otros CRISPR, en particular CRISPR-Cas9, que se dirige al ADN). Debido a esto, CRISPR-Rx puede suprimir la expresión génica con un código genético sin cambios [29] [30] .

Los sistemas de primera clase se caracterizan por complejos efectores multiproteicos (Cascade, Cmr, Csm). Esta clase incluye los sistemas de los tipos I, III y IV. Los sistemas de tipo I son los sistemas CRISPR-Cas más comunes. Sus objetivos son dsDNA que contiene el motivo PAM, y la destrucción se lleva a cabo por el complejo multiproteico efector Cascade asociado con la proteína Cas3. Los sistemas de tipo III son comunes en arqueas y se caracterizan por complejos multiproteicos Csm y Cmr. Pueden reconocer tanto el ADN como el ARN, y el reconocimiento del ADN no requiere PAM. En sistemas de este tipo, la destrucción de las dianas la lleva a cabo la proteína Cas10 junto con nucleasas efectoras, a saber, Cmr4 en el subtipo IIIA ( RNasa , que forma parte del complejo Cmr) y Csm3 en el subtipo IIIB (RNasa, que forma parte del complejo Csm). Los sistemas de tipo IV son bastante raros, su distribución y mecanismo de acción no se conocen bien [27] .

Los sistemas de clase II tienen una única proteína efectora. Esta clase incluye los tipos II y V. Los sistemas de tipo II se utilizan activamente en ingeniería genética; se caracterizan por la presencia de la endonucleasa Cas9 . En sistemas de este tipo, el ARN guía no es un crRNA, sino un dúplex de crRNA y un ARN adicional, tracrRNA. El dúplex crRNA:tracrRNA dirige los dominios RuvC y HNH Cas9 nicase para introducir roturas de extremos romos en el ADN objetivo, que debe tener un PAM cerca del extremo 3'[ aclarar ] . Los sistemas de tipo V son raros y se caracterizan por la presencia de la nucleasa Cpf1, que es dirigida por crRNA al ADN diana. Esta nucleasa similar a RuvC hace un corte en un sitio distal al extremo 3' de PAM. A diferencia de Cas9, esta nucleasa corta el dsDNA con la formación de extremos pegajosos, en lugar de romos, de 5 nucleótidos de largo [31] .

La siguiente tabla enumera los genes característicos de los sistemas CRISPR-Cas estudiados, así como las funciones de las proteínas que codifican. La presencia de ciertos genes característicos sirve como un rasgo característico de los tipos y subtipos de sistemas CRISPR-Cas.

Genes distintivos de subtipos de sistemas CRISPR-Cas
subtipo genes distintivos Funciones de los productos proteicos [14] [27] [28] [32]
I A Cas8a2, Csa5 Cas8a2 está involucrado en la interferencia (se une a crRNA y al objetivo). Csa5 - pequeña subunidad del complejo efector
BI Cas8b Participa en la interferencia (reconoce RAM)
CI Cas8c Participa en la interferencia (reconoce RAM)
IDENTIFICACIÓN Cas10d Participa en la interferencia (se une a crRNA y el objetivo e introduce una ruptura en el objetivo)
ES DECIR Cse1, Cse2 Cse1 posiblemente interactúa con Cas3 y lo recluta para el complejo efector [33] . Cse2 - pequeña subunidad del complejo efector
SI Csy1, Csy2, Csy3, Cas6f Csy2 y, en menor medida, Csy1 y Csy3 están involucrados en la formación de crRNA [34] . Cas6f es una endoribonucleasa dependiente de metales involucrada en la formación de crRNA
II-A Csn2 Involucrado en la adquisición de espaciadores, posiblemente protegiendo el ADN cromosómico de la introducción de roturas de doble cadena.
II-B Cas9 Contiene dos dominios de endonucleasa que introducen roturas de una sola cadena y actúan juntas: una rotura de doble cadena. Participa en el procesamiento de crRNA, su acumulación, así como la destrucción del objetivo.
II-C desconocido —
III-A cm2 Pequeña subunidad del complejo efector
III-B cmr5 Pequeña subunidad del complejo efector
IV Csf1 Participa en la interferencia (reconoce RAM)
V cpf1 Participa en la interferencia (contiene dominio de nucleasa)

Sistemas tipo I y III

Como se mencionó anteriormente, tanto los sistemas de tipo I como de tipo III utilizan complejos efectores multiproteicos. También están unidos por el uso de la proteína Cas6 para el procesamiento de pre-crRNA (a veces se reemplaza por un ortólogo , Cas5). Estas y algunas otras similitudes entre los sistemas de tipo I y III hablan a favor de su descendencia de un ancestro común [14] .

Escribo

Los sistemas de tipo I se subdividen en seis subtipos (IA, IB, IC, ID, IE, IF) en función de las secuencias de aminoácidos de las proteínas del complejo efector y la disposición mutua de sus genes ( sintenia ) [35] . El sistema de subtipos IE de E. coli [14] es el más estudiado .

En los sistemas de tipo I, el complejo efector, Cascade, incluye Cas6 como una subunidad integral , de modo que el procesamiento de crRNA ocurre dentro del complejo efector y el crRNA maduro permanece asociado con él. Luego, el complejo busca su secuencia objetivo; al mismo tiempo, probablemente primero reconoce su PAM y solo después de eso verifica las posiciones clave del protospacer para la complementariedad de crRNA . Dado que no hay PAM en las repeticiones CRISPR, el genoma de una bacteria que tiene un sistema CRISPR-Cas de tipo I está protegido de manera confiable contra la destrucción por este sistema. Cuando se une a Cascade, el protoespaciador forma un bucle R en el dsDNA de destino, lo que requiere un superenrollamiento negativo ; esto probablemente facilita el desenrollado del ADN independientemente de los nucleótidos trifosfato (NTP). El complejo Cascade-protospacer es reconocido por la proteína Cas3. Cas3 tiene un dominio de nucleasa HD, así como un dominio de desenrollado-translocación que requiere NTP para su funcionamiento. Cas3 puede desenrollar dúplex ADN:ADN y ADN:ARN. El dominio HD generalmente se encuentra en el extremo N de Cas3 [32] . El dominio HD introduce una muesca en el objetivo cerca del PAM, después de lo cual Cas3 se separa de Cascade y usa su dominio de hidrólisis de nucleósido trifosfato para avanzar más a lo largo del ADN, introduciendo muescas adicionales en el camino [14] .

La estructura en cascada (libre y unida al ADN) de E. coli se visualizó con una resolución casi atómica . El objetivo es reconocido por el apareamiento de bases de Watson-Crick , aunque cada sexto nucleótido protospacer no es complementario al nucleótido crRNA correspondiente. En este sentido, la geometría general del complejo ADN-ARNcr no corresponde a la doble hélice : las vueltas semi-helicoidales repetitivas del dúplex son interrumpidas por bases desapareadas , lo que permite que el ADN se doble sobre el ARNcr sin envolverse. alrededor. La unión en cascada al objetivo y su secuencia relacionada tiene diferentes cinéticas y características estructurales, lo que permite que el complejo distinga entre el objetivo y las secuencias cercanas. En el primer caso, sigue la interferencia y destrucción del objetivo, y en el segundo, la inserción de un nuevo espaciador. Tal adaptación dirigida, en contraste con la adaptación primaria, "ingenua", requiere el trabajo no solo de las proteínas Cas1 y Cas2, sino también de Cas3 [14] .

Además de 6 subtipos de sistemas de tipo I (IA - IF), se conoce otro subtipo, IU (U del inglés  unchacterized  - uncharacterized, ya que se desconoce el mecanismo de corte de pre-crRNA y la arquitectura del complejo efector). A diferencia de la mayoría de los sistemas de tipo I, el dominio HD de la proteína Cas3 en IU está ubicado en el extremo C-terminal [32] .

Tipo III

Los sistemas de tipo III se dividen en dos subtipos: III-A y III-B. Se caracterizan por la presencia de la proteína Cas10, la subunidad más grande del complejo efector Csm (en el caso del subtipo III-A) y Cmr (en el caso del subtipo III-B). Además, todos los sistemas de tipo III codifican una proteína Cas5 y, por regla general, varias proteínas Cas7 parálogas [32] . Ambos subtipos se caracterizan por el uso del ortólogo Cas6 para el procesamiento de pre-crRNA, aunque la enzima de procesamiento no siempre es un componente estable del complejo efector correspondiente (como en los sistemas de tipo I). En 2008, se demostró que el sistema III-A de Staphylococcus epidermidis funciona con objetivos de ADN, y en 2009, se descubrió que el sistema III-B de Pyrococcus furiosus  funciona con ARN. Para el éxito del reconocimiento de objetivos, los sistemas III-A y III-B no requieren la presencia de un motivo PAM [14] .

El estudio adicional de los sistemas de tipo III reveló nuevos misterios en la especificidad de sustrato de los subtipos III-A y III-B. Por lo tanto, resultó que el sistema III-A de S. epidermidis solo puede funcionar con protospacers transcritos. Además, resultó que los complejos Csm de S. thermophilus y Thermus thermophilus tienen actividad degradante de ARN latente e introducen rupturas en el ARN cada 6 nucleótidos. También se mostró la misma actividad para los complejos Cmr. El sistema III-A de S. epidermidis no solo destruye los transcritos sintetizados, sino que también corta el ADN diana de manera dependiente de la transcripción a expensas de residuos de aminoácidos Cas10 específicos que no están asociados con el reconocimiento de la diana. La hidrólisis de ARN mediada por los complejos Csm y Cmr no es catalizada por la proteína Cas10 sino por las subunidades Csm3 y Cmr4, respectivamente. Por tanto, el sistema III-A puede degradar tanto el ADN como el ARN; se supone que la actividad de degradación del ARN bien descrita de los sistemas III-B se complementa con la capacidad de degradar el ADN [14] .

Dado que los sistemas de tipo III no requieren la presencia de PAM en los objetivos, en su caso debe haber un mecanismo diferente al de los sistemas de tipo I para distinguir entre el dsDNA propio y el extraño. En el caso del complejo Csm, el crRNA es complementario no solo al espaciador CRISPR, sino también a la repetición adyacente. Por lo tanto, al unirse a la molécula diana, el crRNA se unirá solo al protoespaciador, y al unirse al ADN celular, también se unirá a la repetición vecina, sobre la base de la cual el sistema III puede distinguir el ADN celular del extraño. Curiosamente, en los sistemas de tipo III, el ADN se corta muy cerca de los sitios donde las bases correspondientes del crRNA y el ADN diana no están emparejadas. Prácticamente nada se conoce sobre los mecanismos de adquisición de nuevos espaciadores en los sistemas tipo III [14] .

Además de los subtipos III-A y III-B comúnmente reconocidos, en 2015 se propuso distinguir también los subtipos III-C y III-D, que ocurren en algunas arqueas. En los sistemas de tipo III-C, la proteína Cas10 muestra la inactivación del dominio ciclasa ; además, su secuencia de aminoácidos difiere significativamente de la de los sistemas Cas10 III-A y III-B. En los sistemas III-D, Cas10 carece de un dominio HD; además, existe un gen csx10 único similar a cas5 . Ambos sistemas III-C y III-D carecen de los genes cas1 y cas2 [32] .

En febrero de 2016, apareció información de que en algunas bacterias con sistemas CRISPR-Cas de tipo III (por ejemplo, la bacteria marina Marinomonas mediterranea ), en lugar de la proteína Cas1 habitual, se entrecruzaba una proteína quimérica Cas1-RT con funciones de transcriptasa inversa . Debido a la presencia de dicha proteína, una bacteria puede integrar en su genoma espaciadores formados a partir de genomas de patógenos con genomas de ARN a través de la transcripción inversa [36] .

Se ha descubierto que los sistemas de tipo III, en particular Cas10, producen segundos mensajeros de oligoadenilatos cíclicos, convirtiendo ATP en un producto cíclico que activa alostéricamente Csm6, que luego ayuda a degradar el ARN viral [37] .

Sistemas Tipo II

Los sistemas CRISPR-Cas tipo II se distinguen por su base genética y mecanismos moleculares inusuales. En particular, los complejos multiproteicos que procesan crRNA en los sistemas de tipo I y III son reemplazados en los sistemas de tipo II por una sola proteína, Cas9, que está involucrada en los tres pasos fundamentales de este sistema. Por lo tanto, los sistemas de tipo II son el tipo más simple de sistema CRISPR-Cas [32] . Además, elementos adicionales exclusivos de los sistemas de tipo II están involucrados en la biogénesis de crRNA. Los sistemas de tipo II se encuentran solo en bacterias y entre los sistemas de tipo I, II y III son los menos comunes. Sin embargo, son los sistemas de tipo II los que han encontrado aplicación como herramienta para editar genomas [14] .

Los sistemas de tipo II se dividen en tres subtipos según la presencia y las secuencias de los genes cas asociados : II-A, II-B y II-C. Además de los genes cas1 y cas2 , que son comunes a todos los sistemas de tipo I–III, los sistemas de tipo II tienen un gen cas9 adicional , que codifica la endonucleasa Cas9. Cas9 participa en la adquisición de nuevos espaciadores, la acumulación de crRNA y la interferencia. Además, los sistemas II-A contienen el gen csn2 , cuyo producto proteico está implicado en la adquisición de espaciadores. En los sistemas II-B, este gen es reemplazado por el gen cas4 , y los sistemas II-C no tienen ni csn2 ni cas4 . La longitud de Cas9 varía en diferentes subtipos, y los sistemas II-C, por regla general, se caracterizan por los ortólogos más cortos [14] . La parte central de Cas9, que está compuesta por el dominio de nucleasa y el grupo rico en arginina característico de esta proteína, probablemente esté codificada por genes derivados de elementos genéticos móviles que no están asociados de ninguna manera con CRISPR. Dada la similitud significativa en las secuencias de aminoácidos entre Cas9 y sus homólogos, que no están asociados con los sistemas CRISPR-Cas, Cas9 no puede considerarse en el sentido completo de la proteína característica de los sistemas de tipo II. Sin embargo, puede considerarse un sello distintivo de estos sistemas [32] .

La biogénesis de crRNA en los sistemas de tipo II tiene una serie de características únicas. En particular, requiere el procesamiento por parte de la RNasa III y la unión de ARN CRISPR codificados en trans específicos (tracrRNA) a pre-crRNA . El tracrRNA contiene una región complementaria a la región de crRNA que se transcribió a partir de la repetición CRISPR. Durante el procesamiento de crRNA, el tracrRNA se une a los crRNA que aún no se han escindido dentro del pre-crRNA, lo que da como resultado la formación de crRNA maduros. El complejo crRNA-tracrRNA-Cas9 maduro resultante contiene un crRNA corto en el que 20–24 nucleótidos son complementarios al extremo 3' del espaciador y 20–24 nucleótidos son complementarios al extremo 5' de la repetición. El primer paso en el procesamiento de pre-crRNA ocurre en regiones complementarias a las repeticiones CRISPR; como resultado, se forma el extremo 3' del crRNA. El posterior truncamiento del extremo 5' por nucleasas desconocidas ocurre dentro de las secuencias correspondientes a los espaciadores CRISPR. La acumulación de crRNA en las células requiere la proteína Cas9, aunque no se sabe si esto se debe a la participación de Cas9 en el procesamiento de crRNA, la estabilización posterior al procesamiento de crRNA por parte de Cas9, o ambos [14] .

El complejo crRNA-tracrRNA-Cas9 reconoce los ADN diana que son complementarios al crRNA y contienen PAM. Al igual que en los sistemas de tipo I, la ausencia de PAM en los loci CRISPR impide que se corte el ADN celular. Primero, Cas9 reconoce PAM, y luego se verifica la complementariedad de crRNA en el ADN adyacente. El corte del ADN diana se lleva a cabo introduciendo dos roturas monocatenarias con los motivos RuvC y HNH de la proteína Cas9, como resultado de lo cual se forma una rotura bicatenaria con extremos romos al final del protoespaciador en la R -bucle más cercano al PAM, tres nucleótidos antes del PAM [14] .

En los sistemas III-C (en particular, en el sistema CRISPR-Cas de Neisseria meningitidis ), se ha descrito un mecanismo alternativo para la biogénesis de crRNA que utiliza promotores ubicados en repeticiones CRISPR. La dirección alternativa de la transcripción puede ocurrir incluso sin la participación de la RNasa III [14] .

Funciones fuera de la inmunidad de los procariotas

A pesar de que las funciones de los sistemas CRISPR-Cas suelen estar asociadas a la inmunidad adaptativa de los procariotas , existe mucha evidencia de la participación de estos sistemas en procesos completamente distintos que no están relacionados con la protección frente a elementos genéticos extraños (por ejemplo , en la regulación del comportamiento de grupo , virulencia , reparación del ADN y evolución del genoma ). A continuación se enumeran brevemente algunos ejemplos conocidos de participación de CRISPR-Cas en procesos no inmunitarios [38] .

Funciones CRISPR no asociadas a la inmunidad adaptativa [38]
Función Tipo de sistema Mecanismo Participación de los genes cas participación de CRISPR Vista Confirmación experimental
Regulación de genes III-B Destrucción del ARNm complementario Sí Sí Pyrococcus furiosus No
Genes que regulan
el comportamiento grupal		 SI

CI		 Basado en
complementariedad parcial
Desconocido		 si

si		 Sí

Desconocido		 Pseudomonas aeruginosa

Myxococcus xanthus		 si

si

Genes reguladores de la virulencia		 II-C

II-B


II-B
Tipo CRISPR desconocido
Modificación de la superficie celular dependiente de Cas9 Regulación a la baja de la producción de lipoproteínas bacterianas
mediada por Cas9 Desconocido Regulación del operón feoAB por complementariedad parcial



 Si

Si

Si
No		 No

No

No
Sí		 Campylobacter jejuni

Francisella novicida

Legionella pneumophila
Listeria monocytogenes 		Sí

Sí

Sí
Sí
remodelación del genoma SI Eliminación de regiones del genoma
mediante autofocalización		 Sí Sí Pectobacterium Sí
Reparación de ADN ES DECIR Reparación de ADN con
Cas1		 Sí No Escherichia coli Sí
Competencia entre
elementos genéticos móviles (MGE)		 SI Orientación específica de los
competidores de SHM		 Sí Sí Fago ICP1
Vibrio cholerae		 Sí
resto de las celdas No determinado Cas1 y Cas2 funcionan de manera similar
a los sistemas toxina-antitoxina ,
desencadenando la inactividad y la subsiguiente muerte celular
durante la infección por fagos .		 Sí No No determinado No

Un ejemplo es el sistema CRISPR-Cas en la delta-proteobacterium depredadora Myxococcus xanthus , que es omnipresente en el suelo . Su ciclo de vida incluye las etapas de formación de cuerpos fructíferos y esporulación, durante las cuales las células individuales se ensamblan en agregados y se diferencian en mixosporas , formando un cuerpo fructífero. Al separarse, las mixosporas se convierten en células bacterianas individuales, y este proceso está estrictamente regulado por señales de detección de quórum y cascadas de señalización intracelular . El sistema CRISPR-Cas de esta bacteria pertenece al tipo IC e incluye 7 genes Cas y el locus CRISPR que contiene 22 espaciadores. Ante la falta de nutrientes, el sistema desencadena la síntesis en las células de la señal A, compuesta por aminoácidos y péptidos , que activa la transcripción del gen fruA (el operón cas también puede activar este gen a través de la proteína Cas8c). Cuando las células entran en contacto entre sí, forman una señal C codificada por el gen csgA , que también activa fruA , que luego promueve la expresión de genes cas . Por lo tanto, los genes cas son parte del circuito de retroalimentación positiva junto con el gen fruA y están involucrados en la formación del cuerpo fructífero y la esporulación de la bacteria [38] .

Los sistemas CRISPR-Cas pueden estar involucrados en la regulación de la virulencia en bacterias patógenas . Por ejemplo, Francisella novicida tiene un sistema de tipo II que consta de cuatro genes cas y un locus CRISPR orientado inversamente que contiene 13 espaciadores. Regula negativamente la expresión de la lipoproteína bacteriana (BLP), un factor de virulencia de superficie. Es este último el que es reconocido por los receptores tipo Toll 2 del sistema inmunológico del huésped , por lo que se requiere una regulación negativa de BLP para una infección exitosa. Se supone que el complejo de Cas9, crRNA pequeño (scaRNA) y tracrRNA se une al transcrito blp y lo destruye por un mecanismo desconocido. Los sistemas CRISPR-Cas están involucrados en la regulación de la virulencia en bacterias como Campylobacter jejuni , Neisseria meningitidis , Legionella pneumophila (en el caso de esta bacteria, solo cas2 de todos los genes cas está involucrado en la regulación de la virulencia ), Listeria monocytogenes ( ver tabla) [38] .

En muchas bacterias, los sistemas CRISPR-Cas se utilizan para regular sus propios genes no relacionados con la virulencia. En particular, en Pseudomonas aeruginosa , el sistema de tipo IF está involucrado en la regulación de genes asociados con la formación de biopelículas . Además, hay sugerencias de que las proteínas Cas1 y Cas2 pueden brindar protección contra los bacteriófagos, actuando de manera similar a los sistemas toxina-antitoxina, es decir, provocando el reposo y la posterior muerte de las células infectadas. Hay evidencia de la participación de los sistemas CRISPR-Cas en la reparación del ADN. Por lo tanto, Cas1, que forma parte del sistema de tipo IE de E. coli , puede interactuar físicamente con las enzimas de reparación y recombinación . La eliminación del gen cas1 o de los loci CRISPR asociados dio como resultado una mayor sensibilidad a los agentes que dañan el ADN y alteraciones en la segregación cromosómica durante la división [38] .

Los sistemas CRISPR-Cas que se dirigen al cromosoma bacteriano pueden desempeñar un papel importante en los reordenamientos genómicos de las bacterias y proporcionar la base genética para la evolución , a  pesar de que, en la mayoría de los casos, las proteínas Cas autodirigidas conducen a la muerte celular. En la bacteria Pectobacterium atrosepticum , se ha demostrado que los ARNcr que se dirigen a las islas cromosómicas adquiridas a través de la transferencia horizontal de genes dan como resultado típicamente la muerte celular, pero se han observado grandes deleciones cromosómicas en algunas células sobrevivientes, incluida la eliminación completa de una isla objetivo alrededor de 100 pares de bases En estos raros casos, las deleciones aumentaron la aptitud general de los mutantes [38] .

Curiosamente, los sistemas CRISPR-Cas están presentes no solo en procariotas, sino también en bacteriófagos y otros elementos genéticos móviles (MGEs). Quizás esta circunstancia esté asociada a la propagación de sistemas CRISPR-Cas en bacterias y arqueas por transferencia horizontal de genes. Los sistemas CRISPR-Cas de dichos elementos pueden dirigirse a otros FEM, proporcionando mecanismos para la competencia entre los FEM. Los MGE que llevan sistemas CRISPR-Cas pueden competir con las islas de patogenicidad bacteriana que se del genoma durante la infección por fagos y se transfieren a otras bacterias en las cápsidas de los fagos . Usando cápsides de fagos para su propia transmisión, las islas de patogenicidad pueden bloquear completamente la reproducción de fagos. Un ejemplo es el sistema CRISPR-Cas del fago ICP1 Vibrio cholerae , que pertenece al tipo IF y tiene 2 genes cas y 9 espaciadores (aparentemente, es homólogo al sistema Yersinia pestis ). Uno de los espaciadores es complementario a la isla de patogenicidad de Vibrio cholerae , de modo que el fago puede competir con las islas de patogenicidad por las cápsidas. Además, el sistema CRISPR-Cas ICP1 puede adquirir nuevos espaciadores, lo que permite que el fago coevolucione con la bacteria huésped [38] [39] .

En 2016, apareció información de que los grandes virus que contienen ADN citoplasmático nuclear tienen un sistema de protección similar a CRISPR y están diseñados para proteger contra los virófagos (en particular, el virófago Zamilon en Mimivirus ). Este sistema de defensa se denominó MIMIVIRE [40] .

Oposición a CRISPR

Se ha establecido que en respuesta a la propagación de ciertos espaciadores CRISPR en la población bacteriana (y, en consecuencia, la propagación de la resistencia a los correspondientes bacteriófagos), los bacteriófagos mutan intensamente e incluso pierden aquellas partes del genoma que con mayor frecuencia les sirven como dianas . para sistemas CRISPR-Cas e integrarse en el genoma bacteriano como espaciadores [21] .

Algunos fagos codifican proteínas específicas (proteínas anti-CRISPR, Acr) que interfieren con los sistemas CRISPR-Cas y promueven la infección. El análisis de los fagos de Pseudomonas aeruginosa permitió aislar varias variedades de proteínas Acr. Inicialmente, las proteínas Acr se describieron en cepas de P. aeruginosa que portan profagos en sus cromosomas. Aunque la mayoría de estas cepas tenían un sistema CRISPR-Cas de tipo IF activo, en algunas cepas el sistema permaneció inactivo incluso en presencia de espaciadores dirigidos a fagos. El análisis molecular de cepas con sistemas inactivos reveló una serie de pequeñas proteínas codificadas por fagos que eran responsables del desarrollo del fenotipo de respuesta a fagos . Las proteínas Acr pueden suprimir el funcionamiento de los sistemas CRISPR-Cas de varias maneras, en particular (en el caso de los sistemas de tipo IF) mediante la unión al complejo Cascade y bloqueando su unión al ADN objetivo o mediante la unión a las proteínas Cas, lo que lleva a la pérdida de su actividad nucleasa [41] .

Se conoce la proteína Acr, que impide la unión de la helicasa -nucleasa Cas3 al complejo de crRNA y otras proteínas Cas que ya se ha unido a su ADN diana. Dado que el complejo de Cas y crRNA asociado con el ADN no permite que el aparato de transcripción se una al ADN, esta proteína Acr convierte al complejo de crRNA y Cas en un represor transcripcional. A partir de octubre de 2015, este es el primer ejemplo conocido de la regulación de la actividad del sistema CRISPR-Cas utilizando un factor proteico [42] . Las proteínas Acr pueden exhibir una fuerte especificidad por el sistema CRISPR-Cas; en particular, las proteínas que bloquearon el sistema IF de P. aeruginosa no tuvieron efecto sobre el sistema IF de P. aeruginosa IE o E. coli . Sin embargo, algunos fagos con genes supresores para el sistema IF de P. aeruginosa también codificaron pequeñas proteínas supresoras que suprimen el sistema IE de P. aeruginosa , pero no el IE de E. coli [41] .

La aparición de mecanismos protectores contra la interferencia CRISPR en los fagos se considera el resultado de una larga coevolución de los fagos y sus huéspedes [22] .

Importancia evolutiva

Según E. V. Kunin , el funcionamiento de los sistemas CRISPR-Cas puede considerarse como un proceso evolutivo que satisface el escenario evolutivo de Lamarck , es decir, los siguientes criterios:

  • Los cambios genómicos en los loci CRISPR (inserción de nuevos espaciadores) son causados ​​por la influencia del medio ambiente (más precisamente, elementos genéticos extraños).
  • Los cambios se limitan a loci genómicos específicos.
  • Los cambios proporcionan adaptación a un impacto específico (a un elemento genético extraño específico) [43] [44] .

Sin embargo, esta visión de CRISPR ha sido criticada. Según A. Wyss, la correspondencia de CRISPR-Cas con los criterios de Lamarck es sólo superficial [43] .

Los sistemas CRISPR-Cas exhiben algunas de las propiedades de la evolución darwiniana  , en particular, apariencias de adquisición aleatoria de espaciadores en toda la población , seguidas de la selección de clones sobrevivientes con la mejor aptitud [21] .

Identificación

Los sistemas CRISPR-Cas están muy extendidos entre bacterias y arqueas [45] , y su rasgo característico es la alternancia de secuencias repetitivas y espaciadores. Debido a esta característica, los loci CRIPSR son bastante fáciles de encontrar en secuencias de ADN largas, ya que con un aumento en el número de repeticiones en un locus, la probabilidad de encontrar un falso positivo disminuye. Entre los programas utilizados para buscar CRISPR basados ​​en la búsqueda de repeticiones separadas por espacios en secuencias largas se encuentran CRT [46] , PILER-CR [47] y CRISPRfinder [48] .

Encontrar CRISPR en datos metagenómicos es más difícil: al usar algoritmos estándar, los loci CRISPR no se pueden recopilar debido a la presencia de muchas repeticiones, así como a variaciones específicas de la cepa. La reacción en cadena de la polimerasa se puede utilizar para aumentar el número de loci CRISPR y luego analizar el contenido de los espaciadores, pero este método solo proporciona información sobre un locus CRISPR específico y solo es aplicable a organismos cuyos genomas están disponibles en bases de datos (para que los cebadores adecuados se puede crear ) [49] [ 50] [51] [52] [53] .

Aplicaciones en ingeniería genética

Antes del descubrimiento de las funciones y mecanismos de acción de los sistemas CRISPR-Cas como métodos para la edición de genomas específicos de locus, los métodos basados ​​en el uso de nucleasas que contienen dedos de zinc ( inglés.  Zinc-finger nucleases, ZFNs ), como así como las endonucleasas TAL , fueron las más intensamente desarrolladas ( nucleasa efectora similar a un activador de transcripción, TALEN ) .  Estos métodos son bastante laboriosos, poco efectivos y costosos: para cada nuevo locus objetivo, se requiere el desarrollo, la expresión y la verificación de un par de polipéptidos completamente nuevos , lo que limita significativamente el alcance de estos métodos [14] [54] .

Sin embargo, en 2012-2013, aparecieron en ingeniería genética métodos fundamentalmente nuevos para manipular material genético basados ​​en el uso de sistemas CRISPR-Cas. Estos métodos son adecuados para la edición dirigida de los genomas tanto de procariotas como de eucariotas (aunque estos últimos no tienen sus propios sistemas CRISPR-Cas, sin embargo, resultó que los elementos del sistema CRISPR-Cas de origen bacteriano se introdujeron artificialmente en un eucariota son capaces de funcionar en un nuevo entorno). Al mismo tiempo, las tecnologías CRISPR-Cas modernas utilizan la proteína Cas9, que es la misma para todos los loci objetivo, y la especificidad de la acción no está determinada por la proteína, sino por el crRNA. Los métodos basados ​​en ZFN y TALEN todavía se utilizan en la actualidad e incluso se prefieren para la investigación clínica, pero la simplicidad, la eficiencia y la rentabilidad de los métodos que utilizan el sistema CRISPR-Cas9 los han convertido en la primera opción entre los métodos para la edición y unión dirigidas del genoma. con ADN [14] [54] .

Los métodos basados ​​en CRISPR-Cas9 están cerca de los mecanismos de acción naturales de estos sistemas: el ARN se utiliza para reconocer una secuencia objetivo que se encuentra cerca de PAM, y la nucleasa Cas9 dirigida por él produce una ruptura de doble cadena en el sitio objetivo. Sin embargo, al editar el genoma eucariótico, el resultado del trabajo de CRISPR-Cas9 no es la destrucción de toda la molécula de ADN, sino la reparación de la rotura de doble cadena producida por Cas9. La reparación se puede realizar tanto por unión de extremos no  homólogos ( NHEJ ) como por recombinación homóloga . La reparación de unión de extremos no homólogos a menudo da como resultado pequeñas inserciones o deleciones que pueden alterar el marco de lectura de los genes que codifican proteínas, lo que resulta en la pérdida de la función del gen objetivo. Al causar muchas roturas de doble cadena, se pueden lograr grandes deleciones e incluso inversiones [14] .

Por el contrario, la reparación por recombinación homóloga implica reemplazar la secuencia eliminada por una nueva secuencia que es complementaria a la plantilla de reparación que crea el propio investigador. Por lo tanto, la recombinación homóloga se puede utilizar para eliminar mutaciones no deseadas , crear nuevos alelos, insertar o fusionar dominios funcionales. Además, la inactivación mutacional de los dominios RuvC o HNH Cas9 convierte esta proteína en una nickasa dirigida por ARN que produce roturas de cadena sencilla en lugar de roturas de cadena doble. La inactivación de ambos dominios convierte a Cas9 en una proteína de unión a ADN guiada por ARN que no corta el objetivo. En este caso, se puede unir un dominio con otras funciones al dominio de unión al ADN, lo que, a su vez, puede causar varios cambios en el locus objetivo: activación o represión de la transcripción, modificación de la cromatina , aumento de la formación de bucles y muchos otros. Además, la forma inactivada de Cas9 (dCas9, Cas9 "muerto") sirve como base para nuevas técnicas de investigación, como la obtención de imágenes mediante fluorescencia o la creación de etiquetas para el posterior aislamiento físico de loci [14] .

A pesar de la efectividad del uso de los sistemas CRISPR-Cas, el origen de Cas9 impone algunas restricciones en la elección de los objetivos de ADN: por ejemplo, cuando se usa Streptococcus pyogenes Cas9 , solo las secuencias seguidas por PAM, a saber, 5'-NGG (donde N es cualquier nucleótido). Sin embargo, la necesidad de PAM no impone restricciones serias en el uso de sistemas CRISPR-Cas9: en el genoma humano, tales secuencias ocurren casi cada 8 a 12 nucleótidos. Antes de ser utilizado en construcciones genéticas, el gen Cas9 debe optimizarse preliminarmente para los codones utilizados de acuerdo con el organismo cuyo genoma se supone que se va a modificar [55] : el gen cas9 de S. pyogenes tiene un bajo contenido de GC (35 %). y para los organismos cuyos genomas tienen una alta composición de GC, puede ser necesaria la optimización del codón Cas9 [56] .

Actualmente, el sistema de tipo CRISPR-Cas II se usa para la edición del genoma, y ​​la proteína SpyCas9 (Cas9 nucleasa de la bacteria S. pyogenes ) es la más utilizada; sin embargo, se están desarrollando proteínas Cas9 alternativas que aumentarán el alcance de CRISPR-Cas. Por ejemplo, las formas truncadas de Cas9 pueden reconocer varias secuencias de PAM. Aunque la edición del genoma se puede realizar de manera eficiente con crRNA y tracrRNA transcritos por separado, el desarrollo de la tecnología de ARN de guía única (sgRNA) ha simplificado este sistema. En este caso, el sistema de cuatro componentes RNase III:crRNA:tracrRNA:Cas9 se reemplaza por el sistema de dos componentes sgRNA:Cas9. Actualmente, el sgRNA se usa con mucha más frecuencia que el crRNA y el tracrRNA por separado. Finalmente, se está trabajando para mejorar la especificidad de Cas9 y reducir los efectos secundarios [14] [54] . A principios de 2016, se publicaron los resultados del trabajo de investigadores estadounidenses, que lograron reducir la cantidad de errores a casi cero [17] .

La entrega de sgRNA y Cas9 a las células objetivo se proporciona mediante varios métodos. Por ejemplo, para esto se pueden usar plásmidos que codifican sgRNA y Cas9, y las células se pueden transfectar (o transformar , en el caso de procariotas) con ellos. Dichos plásmidos pueden administrarse en las células mediante electroporación [57] . En algunos casos, resulta más conveniente usar plásmidos que codifican Cas9 y entregar ARN en forma de amplicones generados por PCR [55] .

En 2015, se propuso un nuevo método para introducir sgRNA y Cas9 en la célula dentro de nanobobinas especiales. Tal nanocoil consiste en una cadena de ADN densamente entrelazada, una de cuyas secciones es complementaria al sgRNA transferido; por lo tanto, el complejo sgRNA:Cas9 se fija dentro de la bobina. Además, la nanobobina es capaz de autoensamblarse. Se pueden unir muchos complejos sgRNA:Cas9 diferentes a una nanobobina. Al entrar en contacto con la célula, la nanoespiral ingresa al endosoma ; sin embargo, un polímero especial que cubre la nanoespiral asegura la destrucción del endosoma y permite que el sgRNA:Cas9 alcance el núcleo [58] .

Modificaciones del método

Para la edición dirigida del genoma de células eucariotas, no solo se utiliza Cas9 de S. pyogenes , sino también Cas9 de Streptococcus thermophilus , Neisseria meningitidis [59] [60] , así como Cas9 de Staphylococcus aureus (SaCas9), que es 25 % más pequeño que SpyCas9, lo que permite empaquetarlo en un virus adenoasociado (AAV) para la entrega del vector en las células de un organismo vivo como agente terapéutico [61] .

Una forma de Cas9 (dCas9) incapaz de cortar el ADN ha encontrado una amplia aplicación. El uso de dCas9 entrecruzado con una proteína fluorescente es la base del nuevo método CASFISH ( CRISPR-Cas9 mediated fluorescence in situ hybridization ) , que permite el marcaje fluorescente de loci diana [62] . Usando este dCas9, uno puede rastrear la longitud de los telómeros , así como observar la dinámica de ciertos loci durante el ciclo celular [63] .

La forma dCas9 se puede usar para suprimir la transcripción de un gen objetivo (cuando se une a este último en la región promotora , las regiones reguladoras o el comienzo de la región codificante); además, se puede ligar un péptido represor a dCas9 para suprimir la transcripción . Por el contrario, dCas9 reticulado con proteínas activadoras de la transcripción ( factores de transcripción y efectores [64] ) puede activar la transcripción del gen diana. Además, se pueden unir endonucleasas de restricción artificiales a dCas9 , así como enzimas que modifican el epigenoma ( ADN metiltransferasas , histona acetiltransferasas ) y, por lo tanto, regulan la actividad de los genes diana [65] [66] [67] . En 2016, las células madre embrionarias de ratón se reprogramaron en dos linajes extraembrionarios (células trofoblásticas y endodérmicas extraembrionarias ) mediante la activación de los genes Cdx2 y Gata6 mediante activadores mediados por CRISPR [68] .

Además, dCas9 se puede entrecruzar con el monómero de endonucleasa FokI , que funciona como dímero . Los dímeros FokI pueden introducir roturas de doble cadena en las secuencias diana. Se utilizan dos sgRNA para dirigir dCas9 reticulado al monómero FokI, lo que aumenta significativamente la precisión del sistema. Cuando dos monómeros, cada uno de los cuales está dirigido por su propio sgRNA, se ubican a una distancia de aproximadamente 30 pares de bases entre sí, FokI se dimeriza e introduce una ruptura de doble cadena [69] .

Para limpiar loci asociados con sgRNA, se puede usar dCas9 que lleva ciertos epítopos . De hecho, este método es una variante especial de inmunoprecipitación de cromatina [70] .

Se han encontrado análogos de Cas9 que pueden escindir moléculas de ARN en lugar de ADN. El uso de estas proteínas permitirá editar o suprimir selectivamente la actividad de los miARN [71] [72] . Francisella novicida Cas9 (FnCas9) se puede reprogramar para atacar el genoma de ARN del virus de la hepatitis C , lo que da como resultado la supresión del ciclo de vida del virus en las células eucariotas. Basado en este sistema, es posible crear cientos de agentes contra varios virus [73] .

En el otoño de 2015, se propuso un nuevo método, una alternativa a CRISPR-Cas9: CRISPR-Cpf1 . Cpf1 es una endonucleasa que es una proteína efectora de los sistemas CRISPR-Cas tipo V. Es más pequeño que Cas9 y solo requiere crRNA para funcionar, no tracrRNA. En este sentido, es posible que en algunos casos el método CRISPR-Cpf1 sea más conveniente que el método CRISPR-Cas9 [74] .

En 2015 , también se propuso un nuevo método CRISPR de autoclonación .  En este caso, se introduce en las células un plásmido que contiene un sgRNA palindrómico autoclonable, así como un ADN corto de doble cadena que contiene la secuencia que codifica el sgRNA deseado. Cuando se transcribe el plásmido, el sgRNA resultante complejado con Cas9 se une de manera complementaria a la secuencia en el plásmido que codifica el sgRNA. Cas9 introduce una rotura de doble cadena, que se repara mediante recombinación homóloga utilizando el ADN de doble cadena introducido como plantilla; como resultado, el plásmido contiene nuevamente la secuencia que codifica el sgRNA deseado. A diferencia del método CRISPR estándar, que requiere una producción larga y laboriosa de plásmidos especiales para cada nuevo locus objetivo, el método CRISPR de autoclonación puede reducir el tiempo del experimento de seis días a tres horas y reducir su costo seis veces [75] .

Actualmente, se están desarrollando intensamente métodos químicos para controlar el funcionamiento de CRISPR-Cas: dosis, duración de la acción, especificidad y otros parámetros [76] [77] .

Implicaciones biotecnológicas y médicas

Actualmente, los métodos CRISPR-Cas se utilizan con éxito en la ingeniería genética de varios organismos: eucariotas y procariotas, tanto multicelulares como unicelulares ( levaduras ) [56] [78] . El uso de CRISPR-Cas en microorganismos permite modificar sus rutas metabólicas , lo que abre oportunidades para el desarrollo de nuevas estrategias biotecnológicas [79] . Además, la creación de cepas de bacterias tecnológicamente importantes resistentes a varios fagos gracias a CRISPR-Cas es de gran importancia para la biotecnología [21] .

Se han desarrollado métodos para editar genomas utilizando CRISPR-Cas para organismos modelo (por ejemplo, ratones [80] , la mosca de la fruta Drosophila melanogaster [81] , el nematodo Caenorhabditis elegans [82] , el pez cebra [83] y otros). Dichos métodos se han utilizado para editar el genoma de los hongos [84] , en particular, el hongo filamentoso Aspergillus oryzae , que se utiliza en la industria para la fermentación de la soja [85] y el champiñón [86] . De gran importancia son los trabajos de edición con la ayuda de cultivos celulares CRISPR-Cas de mamíferos , incluidos los humanos [87] . En 2017, el genoma de embriones humanos fue editado por este método [88] .

Se está trabajando en la edición de genomas mediante CRISPR-Cas en bovinos [89] , cerdos [90] y otros animales de gran importancia económica, como las abejas [91] . En noviembre de 2015 se publicaron los resultados de un experimento en el que se inactivaron 62 retrovirus endógenos en el genoma del cerdo mediante la tecnología CRISPR-Cas . Los autores del estudio esperan que, debido a estos resultados, el xenotrasplante de órganos de un cerdo a un ser humano sea posible en el futuro [92] . Finalmente, la mutagénesis CRISPR-Cas se puede usar para controlar especies invasoras (por ejemplo, la mosca invasora Drosophila suzukii)[93].

La tecnología CRISPR-Cas se ha aplicado con éxito en la ingeniería genética de plantas [94] , incluidas las plantas ornamentales (por ejemplo, petunias [95] ) y muchos cultivos importantes: arroz [96] , soja [97] , trigo , sorgo , maíz , tomate [98] y naranja [99] . Se está investigando la posibilidad de introducir sistemas CRISPR-Cas en plantas cultivadas para crear inmunidad antiviral [100] [101] . El sistema CRISPR-Cpf1 [102] también se puede utilizar para la ingeniería genética de plantas .

Los métodos basados ​​en CRISPR-Cas también se pueden utilizar en medicina [103] para el tratamiento de una amplia variedad de enfermedades: virales (incluidas la infección por VIH [104] [105] y las infecciones por herpesvirus [106] ), alergias y enfermedades inmunológicas ( incluyendo enfermedades autoinmunes [107] ) [108] , oncológicas [109] [110] [111] , enfermedades cardiovasculares [112] e incluso reumatismo [113] , así como trastornos hereditarios [114]  como el síndrome de Down , anemia de células falciformes [ 115] , retinitis pigmentosa [116] y β-talasemia [117] . En 2013, apareció una publicación [118] que informaba que los investigadores pudieron editar un gen anormal en las células madre de un paciente con fibrosis quística . Es posible que el sistema CRISPR-Cas pueda ayudar en el tratamiento de la distrofia muscular de Duchenne (DMD): se ha demostrado que CRISPR-Cas puede restaurar el gen de la distrofina en cultivos de células de DMD [119] . Se supone que dichas células con un genoma "reparado" se pueden trasplantar al cuerpo del paciente, donde pueden reemplazar las células enfermas y realizar las funciones necesarias [54] . En octubre de 2016, se editó en China un genoma humano adulto utilizando CRISPR/Cas: a un paciente con cáncer de pulmón se le inyectaron linfocitos T modificados con CRISPR-Cas [120] . Los investigadores creen que la edición del genoma del mosquito de la malaria mediante CRISPR-Cas puede ayudar a combatir la malaria [121] [122] . Se demostró la posibilidad de editar el genoma de otro importante protozoo patógeno, Toxoplasma gondii , utilizando CRISPR-Cas [123] .

El sistema CRISPR-Cas se puede utilizar para obtener tejidos resistentes a la inflamación a partir de células pluripotentes humanas [124] .

Los métodos CRISPR-Cas han demostrado ser efectivos en la manipulación del locus PRPN , que codifica una proteína priónica responsable de varias enfermedades neurodegenerativas en humanos y otros mamíferos [125] .

Las líneas celulares modificadas con CRISPR-Cas se pueden utilizar como modelos para diversas enfermedades humanas. Por ejemplo, se obtuvieron células con mutaciones correspondientes a dos enfermedades renales ( enfermedad renal poliquística y glomeruloesclerosis focal y segmentaria ) de una línea celular humana pluripotente usando CRISPR-Cas . Más tarde, a partir de estas células se cultivaron miniórganos correspondientes a los riñones de una persona con estas enfermedades [126] . El mismo método se ha utilizado para modelar el síndrome de QT largo en cardiomiocitos . Dichos modelos pueden ayudar en el estudio de enfermedades y el desarrollo de nuevos fármacos [127] .

Edición de ADN para contrarrestar la infección por VIH

En noviembre de 2018, se supo que un equipo de científicos chinos dirigido por He Jiankui logró crear las primeras personas del mundo con genes modificados artificialmente ( CCR5 deshabilitado ): dos niñas gemelas que se supone que son inmunes al virus de la inmunodeficiencia humana [128] [129] . Este experimento ha sido criticado por violar numerosas reglas científicas y éticas [130] .

Reacción pública

En 2015, al menos cuatro laboratorios en los EE. UU., laboratorios en China y el Reino Unido , así como la empresa estadounidense de biotecnología Ovascience, anunciaron sus planes para modificar los genomas de embriones humanos utilizando CRISPR-Cas [131] . A la luz de estos acontecimientos, muchos científicos abogaron por la introducción de una moratoria internacional sobre el uso de la tecnología CRISPR-Cas en embriones humanos y células de línea germinal , incluso con fines médicos [132] [133] . Estos científicos respaldaron más investigaciones básicas sobre CRISPR; sin embargo, en su opinión, la tecnología CRISPR-Cas aún no está lo suficientemente desarrollada para garantizar la ausencia de mutaciones adversas y defectos hereditarios en los pacientes cuando se aplica en la práctica clínica [134] .

En abril de 2015, un grupo de científicos chinos publicó un artículo en la revista Protein & Cell informando los resultados de su intento de cambiar el ADN de embriones humanos no viables usando CRISPR-Cas. Estaban tratando de corregir la mutación que conduce a la beta talasemia [15] . Según el investigador principal, Nature and Science rechazó el artículo debido a consideraciones éticas [135] . Los resultados del experimento no fueron muy optimistas debido a las numerosas mutaciones que se produjeron fuera del gen diana. Los autores del estudio afirmaron que en la actualidad la tecnología CRISPR-Cas aún no está lista para su uso en medicina reproductiva [15] .

En diciembre de 2015, se celebró en Washington la Cumbre Internacional sobre Edición de Genes Humanos bajo la presidencia de David Baltimore . Durante esta cumbre, representantes de las academias nacionales de ciencias de los Estados Unidos, Gran Bretaña y China discutieron los problemas éticos de la modificación genética en células germinales humanas. Durante la reunión, se decidió continuar con la investigación básica y clínica sobre las bases legales y éticas apropiadas. Se ha llamado especialmente la atención sobre la diferencia entre el uso clínico de las células somáticas , en las que la propagación de las mutaciones producidas se limita a un individuo, y las células germinales , cuyas anomalías genómicas pueden ser heredadas por la siguiente generación. Esto último puede tener consecuencias imprevistas y de largo alcance para la evolución humana  , tanto genéticas como culturales [136] .  

En febrero de 2016, un grupo de científicos británicos obtuvo permiso para modificar genéticamente embriones humanos utilizando CRISPR-Cas y métodos relacionados [137] [138] .

En 2012 y 2013, al comienzo del avance con CRISPR en ingeniería genética, el método CRISPR-Cas fue nominado para el premio Avance del año por el programa de televisión Science Magazine . En 2015 ganó este premio [139] .

Véase también

Notas

  1. ↑ Biomolécula. Sistemas CRISPR: inmunización de procariotas .
  2. ↑ Makarova K. S., Haft D. H., Barrangou R., Brouns S. J., Charpentier E., Horvath P., Moineau S., Mojica F. J., Wolf Y. I., Yakunin A. F., van der Oost J., Koonin E. V. Evolución y clasificación de CRISPR- Sistemas cas  // Reseñas de la naturaleza. microbiología. - 2011. - vol. 9, núm. 6.- Pág. 467-477. -doi : 10.1038/ nrmicro2577 . —PMID 21552286 .
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Literatura

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