Los vectores virales son herramientas comúnmente utilizadas por los biólogos moleculares para llevar material genético a las células . Este proceso se puede realizar dentro de un organismo vivo ( in vivo ) o en cultivo celular ( in vitro ). Los virus tienen mecanismos moleculares especializados para transportar eficientemente sus genomas dentro de las células que infectan. La entrega de genes u otro material genético por un vector se llama transducción , y las células infectadas se describen como transducidas. Los biólogos moleculares utilizaron por primera vez este mecanismo en la década de 1970. Paul Berg usó un SV40 modificado que contenía ADN del bacteriófago λ para infectar células de riñón de mono cultivadas [1] .
Además de su uso en la investigación de biología molecular, los vectores virales se utilizan para la terapia génica y el desarrollo de vacunas .
Los vectores virales se adaptan a su aplicación específica, pero normalmente comparten algunas propiedades clave.
Los vectores virales se desarrollaron originalmente como una alternativa a la transfección de ADN nativo para experimentos de genética molecular . En comparación con los métodos tradicionales, como la precipitación con fosfato de calcio, la transducción puede garantizar que casi el 100 % de las células se infecten sin afectar seriamente la viabilidad celular. Además, algunos virus se integran en el genoma celular , promoviendo una expresión estable.
Las proteínas codificadas por genes se pueden expresar utilizando vectores virales, generalmente para estudiar la función de una proteína en particular. Los vectores virales, especialmente los retrovirus, que expresan de manera estable genes marcadores como GFP se usan ampliamente para marcar células de manera permanente y rastrearlas a ellas y a su progenie, como en experimentos de xenotrasplante , donde las células infectadas in vitro se implantan en un animal huésped.
La inserción de genes es más barata que la eliminación de genes . Pero esto da resultados menos confiables, porque a veces no es específico y tiene efectos fuera del objetivo en otros genes. Los vectores animales huéspedes también juegan un papel importante.
La terapia génica es un método para corregir genes defectuosos responsables del desarrollo de una enfermedad. En el futuro , la terapia génica puede proporcionar una manera de tratar los trastornos genéticos , como la inmunodeficiencia combinada grave , la fibrosis quística o incluso la hemofilia A. Debido a que estas enfermedades resultan de mutaciones en la secuencia de ADN de ciertos genes, los ensayos de terapia génica han utilizado virus para entregar copias de tipo salvaje de estos genes en las células del cuerpo del paciente. Ha habido una gran cantidad de éxito de laboratorio con la terapia génica. Sin embargo, se deben superar varios problemas con la terapia génica viral antes de que se use ampliamente. La respuesta inmunitaria a los virus no solo impide la entrega de genes a las células objetivo, sino que también puede causar complicaciones graves para el paciente. En uno de los primeros ensayos de terapia génica en 1999, esto resultó en la muerte de Jesse Gelsinger , quien fue tratado con un vector adenoviral. [2]
Algunos vectores virales, como los retrovirus gamma, insertan sus genomas en una ubicación aparentemente aleatoria en uno de los cromosomas del huésped , lo que puede alterar la función de los genes celulares y provocar cáncer. En 2002, en un estudio de terapia génica retroviral de inmunodeficiencia combinada grave , cuatro pacientes desarrollaron leucemia como resultado del tratamiento; [3] tres pacientes se recuperaron después de la quimioterapia. [4] Los vectores basados en virus adenoasociados son mucho más seguros en este sentido, ya que siempre se integran en el mismo lugar del genoma humano, siendo utilizados en diversos trastornos como la enfermedad de Alzheimer [5] .
Los virus que expresan proteínas patógenas se están desarrollando actualmente como vacunas contra estos patógenos basándose en la misma lógica que las vacunas de ADN . Los linfocitos T reconocen las células infectadas con parásitos intracelulares basándose en proteínas extrañas producidas en la célula. La inmunidad de las células T es crítica para la protección contra infecciones virales y enfermedades como la malaria . La vacuna viral induce la expresión de proteínas patógenas en las células huésped de manera similar a la vacuna contra la poliomielitis de Sabin y otras vacunas atenuadas. Sin embargo, dado que las vacunas virales contienen solo una pequeña fracción de los genes del patógeno, son mucho más seguras y la infección esporádica por el patógeno no es posible.
En el siglo XXI, se están desarrollando activamente vacunas basadas en vectores de adenovirus [6] .
Los retrovirus son una de las bases de los enfoques modernos de terapia génica. Los retrovirus recombinantes, como el virus de la leucemia murina de Moloney, pueden integrarse de forma estable en el genoma del huésped. Contienen transcriptasa inversa para crear una copia de ADN del genoma de ARN e integrasa, lo que permite la integración en el genoma del huésped . Se han utilizado en varios ensayos clínicos aprobados por la FDA, como el estudio SCID-X1 [7] .
Los vectores retrovirales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. Los vectores de replicación deficiente son la opción más común en la investigación porque los virus tienen las regiones de codificación de los genes necesarios para rondas adicionales de replicación y el empaque del virión se reemplaza por otros genes o se eliminan. Estos virus pueden infectar las células diana y entregar la carga viral, pero luego no pueden continuar la vía lítica típica que conduce a la lisis y muerte celular.
Por el contrario, los vectores virales competentes para la replicación contienen todos los genes necesarios para la síntesis de viriones y continúan proliferando tan pronto como ocurre la infección. Dado que el genoma viral de estos vectores es mucho más largo, la longitud del gen de interés real insertado es limitada en comparación con la posible longitud del inserto para vectores defectuosos en la replicación. Dependiendo del vector viral, la longitud máxima típica de un inserto de ADN válido en un vector viral defectuoso en la replicación es típicamente alrededor de 8-10 kB. [8] Aunque esto limita la introducción de muchas secuencias genómicas, la mayoría de las secuencias de cDNA todavía se pueden acomodar.
La principal desventaja de usar retrovirus como el retrovirus Moloney es la necesidad de una división celular activa para la transducción . Como resultado, células como las neuronas son altamente resistentes a la infección y transducción por retrovirus.
Existe la preocupación de que la mutagénesis por inserción debida a la integración en el genoma del huésped pueda provocar cáncer o leucemia . Este problema siguió siendo teórico hasta que la terapia génica para diez pacientes con SCID-X1 usando el virus de la leucemia de ratón Maloney [9] resultó en dos casos de leucemia causada por la activación del oncogén LMO2 debido a la estrecha integración del vector. [diez]
Los lentivirus son una subclase de retrovirus. A veces se utilizan como vectores de terapia génica debido a su capacidad para integrarse en el genoma de las células que no se dividen, lo cual es exclusivo de los lentivirus porque otros retrovirus solo pueden infectar células en división. El genoma viral, en forma de ARN , se somete a una transcripción inversa cuando el virus ingresa a la célula para producir ADN , que luego se inserta en el genoma en una posición aleatoria (hallazgos recientes en realidad sugieren que la inserción de ADN viral no es aleatoria, sino está dirigido a genes activos específicos y asociado con la organización del genoma [11] ) por una enzima integrasa viral . El vector, ahora llamado provirus , permanece en el genoma y se transmite a la descendencia de la célula cuando se divide. El sitio de integración es impredecible, lo que puede crear un problema. El provirus puede interrumpir la función de los genes celulares y conducir a la activación de oncogenes promotores del cáncer , lo que plantea preocupaciones sobre el posible uso de lentivirus en la terapia génica. Sin embargo, los estudios han demostrado que los vectores lentivirales tienen menos tendencia a integrarse en sitios que pueden causar cáncer que los vectores gamma-retrovirales. [12] Más específicamente, un estudio mostró que los vectores lentivirales no causaron un aumento en la incidencia de tumores ni una aparición más temprana de tumores en ratones con una incidencia significativamente mayor de tumores. [13] Además, no se observó un aumento en los eventos mutagénicos u oncológicos en estudios clínicos que utilizaron vectores lentivirales para administrar terapia génica para el tratamiento del VIH.
Por razones de seguridad, los vectores lentivirales nunca portan los genes necesarios para su replicación. Para obtener lentivirus, se transfectan varios plásmidos en una llamada línea celular de empaquetamiento, generalmente HEK 293 . Uno o más plásmidos, comúnmente denominados plásmidos de empaquetamiento, codifican proteínas de virión , como la cápside y la transcriptasa inversa . El otro plásmido contiene el material genético que será entregado por el vector. Se transcribe para producir el genoma de ARN monocatenario viral y está marcado por la presencia de la secuencia ψ (psi). Esta secuencia se utiliza para empaquetar el genoma en un virión.
A diferencia de los lentivirus, el ADN adenoviral no se integra en el genoma y no se replica durante la división celular. Esto limita su uso en investigación básica, aunque los vectores adenovirales todavía se usan en experimentos in vitro e in vivo . [14] Su uso principal es en terapia génica y vacunación [15] [16] . Así es como se usa el adenovirus humano para la vacuna Sputnik V. Dado que los humanos comúnmente entran en contacto con adenovirus que causan infecciones respiratorias, gastrointestinales y oculares, la mayoría de los pacientes ya han desarrollado anticuerpos neutralizantes que pueden inactivar el virus antes de que llegue a la célula diana. Para superar este problema, los científicos están investigando actualmente adenovirus que infectan a diferentes especies a las que los humanos no tienen inmunidad.
El virus adenoasociado (AAV) es un virus pequeño que infecta a los humanos y algunas otras especies de primates. Actualmente se sabe que AAV no causa enfermedad y provoca una respuesta inmune muy débil. El AAV puede infectar tanto células en división como no en división y puede incorporar su genoma en el genoma de la célula huésped. Además, AAV permanece principalmente episomal (replicación sin inclusión en el cromosoma); cumpliendo una expresión larga y estable. [17] Estas características hacen de AAV un candidato muy atractivo para el desarrollo de vectores virales para la terapia génica. [1] Sin embargo, AAV solo puede generar hasta 5 KB, que es significativamente menor que la capacidad original de AAV. [17]
Además, debido a su uso potencial como vector de terapia génica, los investigadores han creado un AAV alterado llamado virus adenoasociado autosuplementario (scAAV). Mientras que AAV empaqueta una hebra de ADN y requiere un proceso de síntesis de una segunda hebra, scAAV empaqueta ambas hebras, que se unen para formar ADN de doble hebra. Al omitir la síntesis de la segunda cadena, scAAV permite una expresión rápida en la célula. [18] De lo contrario, scAAV comparte muchas de las características de su contraparte AAV.
Los vectores híbridos son virus vectoriales que se modifican genéticamente para que tengan las propiedades de más de un vector. Los virus se modifican para evitar las deficiencias de los vectores virales típicos, que pueden tener una capacidad de carga, inmunogenicidad y genotoxicidad limitadas, y pueden no ser compatibles con la expresión transgénica adecuada a largo plazo . Al reemplazar elementos no deseados con capacidades deseables, los vectores híbridos pueden en el futuro superar a los vectores de transfección estándar en términos de seguridad y eficacia terapéutica. [19]
La elección de un vector viral para llevar material genético a las células está asociada con algunos problemas logísticos. Hay un número limitado de vectores virales disponibles para uso terapéutico. Cualquiera de estos pocos vectores virales puede provocar una respuesta inmunitaria del huésped si el vector se considera un invasor extraño. [20] [21] Una vez usado, el vector viral no puede volver a usarse de manera efectiva en un paciente porque será reconocido por el cuerpo. Si una vacuna o terapia génica falla en los ensayos clínicos , el virus no se puede volver a utilizar en un paciente para otra vacuna o terapia génica en el futuro. La inmunidad preexistente contra el vector viral también puede estar presente en el paciente, lo que hace que la terapia sea ineficaz para ese paciente. [20] [22] Es posible contrarrestar la inmunidad preexistente cuando se usa un vector viral para la vacunación cebando con una vacuna de ADN no viral , pero este método presenta otro problema y obstáculo en el proceso de distribución de la vacuna. [23] La inmunidad existente también se puede desafiar aumentando la dosis de la vacuna o cambiando la vía de vacunación . [24] Algunas desventajas de los vectores virales (como la genotoxicidad y la baja expresión de transgenes) se pueden superar con vectores híbridos.