Cultivo de células
La versión actual de la página aún no ha sido revisada por colaboradores experimentados y puede diferir significativamente de la versión revisada el 24 de mayo de 2021; las comprobaciones requieren 5 ediciones .El cultivo celular es un proceso mediante el cual células individuales (o una sola célula) de procariotas y eucariotas se cultivan in vitro en condiciones controladas . En la práctica, el término " cultivo celular " se refiere principalmente al cultivo de células de un solo tejido derivadas de eucariotas multicelulares, más comúnmente animales. El desarrollo histórico de la tecnología y las técnicas para cultivar cultivos celulares está indisolublemente ligado al cultivo de tejidos y órganos completos.
Historia
En el siglo XIX, el fisiólogo inglés S. Ringer desarrolló una solución salina [1] que contenía cloruros de sodio, potasio, calcio y magnesio para mantener los latidos del corazón de los animales fuera del cuerpo. En 1885, Wilhelm Roux estableció el principio del cultivo de tejidos, extrajo parte de la médula ósea de un embrión de pollo y la mantuvo en solución salina tibia durante varios días [2] . Ross Granville Harrison , quien trabajó en la Escuela de Medicina Johns Hopkins y luego en la Universidad de Yale , publicó los resultados de sus experimentos en 1907-1910, creando una metodología de cultivo de tejidos. En 1910, Peyton Rous , trabajando con cultivo de células de sarcoma de pollo , indujo la formación de tumores en animales sanos. Esto condujo más tarde al descubrimiento de los virus oncogénicos ( Premio Nobel de Fisiología o Medicina 1966).
Las técnicas de cultivo celular se desarrollaron significativamente en las décadas de 1940 y 1950 en relación con la investigación en el campo de la virología. El cultivo de virus en cultivos celulares permitió obtener material viral puro para la producción de vacunas. La vacuna contra la poliomielitis fue uno de los primeros medicamentos producidos en masa utilizando tecnología de cultivo celular. En 1954, Enders , Weller y Robbins recibieron el Premio Nobel "por su descubrimiento de la capacidad del virus de la poliomielitis para crecer en cultivos de diversos tejidos". En 1952, se desarrolló la conocida línea celular de cáncer humano HeLa .
Principios básicos del cultivo
Aislamiento celular
Para el cultivo fuera del cuerpo, las células vivas se pueden obtener de varias formas. Las células se pueden aislar de la sangre, pero solo los leucocitos pueden crecer en cultivo. Las células mononucleares se pueden aislar de los tejidos blandos utilizando enzimas como la colagenasa , la tripsina y la pronasa que destruyen la matriz extracelular [3] . Además, se pueden colocar trozos de tejidos y materiales en el medio nutritivo.
Los cultivos celulares tomados directamente del objeto ( ex vivo ) se denominan primarios [4] . La mayoría de las células primarias, con la excepción de las células tumorales, tienen una vida útil limitada. Después de un cierto número de divisiones, dichas células envejecen y dejan de dividirse, aunque aún pueden permanecer viables.
Hay líneas celulares inmortalizadas ("inmortales") que pueden reproducirse indefinidamente. En la mayoría de las células tumorales, esta capacidad es el resultado de una mutación aleatoria , pero en algunas líneas celulares de laboratorio se adquiere artificialmente, mediante la activación del gen de la telomerasa [5] [6] .
Cultivo celular
Las células se cultivan en medios nutritivos especiales a una temperatura constante. Para cultivos de células vegetales, se utiliza iluminación controlada, y para células de mamíferos, también se suele requerir un ambiente gaseoso especial, mantenido en una incubadora de cultivo celular [7] [8] . Como regla general, se regula la concentración de dióxido de carbono y vapor de agua en el aire, pero a veces también el oxígeno. Los medios nutritivos para diferentes cultivos celulares difieren en composición, pH , concentración de glucosa , composición de factores de crecimiento, etc. [9] . Los factores de crecimiento utilizados en los medios de cultivo de células de mamíferos se agregan más comúnmente junto con el suero sanguíneo . Uno de los factores de riesgo en este caso es la posibilidad de infección del cultivo celular con priones o virus. En el cultivo, una de las tareas importantes es evitar o minimizar el uso de ingredientes contaminados. Sin embargo, en la práctica esto no siempre se logra. La mejor manera, pero también la más costosa, es agregar factores de crecimiento purificados en lugar de suero [10] .
Las células se pueden cultivar en suspensión o en estado adhesivo . Algunas células (como las células sanguíneas ) existen naturalmente en suspensión. También existen líneas celulares modificadas artificialmente para que no se adhieran a las superficies; esto se hace para aumentar la densidad de células en cultivo. El crecimiento de células adherentes requiere una superficie, como cultivo de tejidos, o plástico recubierto con elementos de matriz extracelular para mejorar las propiedades adhesivas, así como para estimular el crecimiento y la diferenciación. La mayoría de las células de los tejidos blandos y duros son adhesivas. Del tipo de cultivo adhesivo se distinguen los cultivos celulares organotípicos, que son un entorno tridimensional, a diferencia de la cristalería de laboratorio convencional. Este sistema de cultivo es física y bioquímicamente el más similar a los tejidos vivos, pero tiene algunas dificultades técnicas de mantenimiento (por ejemplo, necesita difusión). Con el fin de proporcionar las condiciones físicas necesarias para cultivar cultivos adhesivos y poblar el volumen de la matriz extracelular de estructuras de ingeniería tisular, se utilizan sistemas de cultivo dinámico [11] basados en biorreactores rotatorios y de vórtice, biorreactores con contacto directo con el andamio: biorreactores de compresión , biorreactores con tensión mecánica y presión hidrostática, biorreactores especiales para estimulación eléctrica de células y tejidos, así como biorreactores combinados [12] .
Contaminación cruzada de líneas celulares
Al trabajar con cultivos celulares, los científicos pueden enfrentarse al problema de la contaminación cruzada.
Características de las células en crecimiento
Al crecer las células, debido a la división constante, puede ocurrir su sobreabundancia en el cultivo y, como resultado, surgen los siguientes problemas:
- Acumulación en el medio nutritivo de productos de excreción, incluidos los tóxicos.
- Acumulación en el cultivo de células muertas que han cesado su actividad vital.
- La acumulación de una gran cantidad de células tiene un efecto negativo en el ciclo celular , el crecimiento y la división se ralentizan, y las células comienzan a envejecer y morir ( inhibición del crecimiento por contacto ).
- Por la misma razón, puede comenzar la diferenciación celular .
Para mantener el funcionamiento normal de los cultivos celulares, así como para prevenir fenómenos negativos, el medio nutritivo se reemplaza periódicamente, las células se pasan y transfectan . Para evitar la contaminación de los cultivos con bacterias, levaduras u otras líneas celulares, todas las manipulaciones se suelen realizar en condiciones asépticas en una caja estéril. Se pueden agregar antibióticos ( penicilina , estreptomicina ) y antifúngicos ( anfotericina B ) al medio de cultivo para suprimir la microflora .
Uno de los productos del metabolismo en las células son los ácidos, como resultado de lo cual el pH del medio disminuye gradualmente. Para controlar la acidez de los medios nutritivos, se les agregan indicadores de pH .
Si el cultivo celular es adherente, el medio nutritivo puede reemplazarse por completo.
Pasaje de células
El paso (separación) de células es la selección de un pequeño número de células para su crecimiento en otro recipiente de laboratorio. Si el cultivo está creciendo rápidamente, esto debe hacerse con regularidad, ya que los nutrientes se agotan en el medio y los productos metabólicos se acumulan . Los cultivos en suspensión son más fáciles de pasar, ya que basta con seleccionar el número requerido de células, colocarlas en otros recipientes y agregar medio nutritivo fresco. Las células adhesivas deben separarse del sustrato antes de esto y sus grupos deben separarse. La mayoría de las veces, se usa una mezcla de tripsina y EDTA u otras mezclas de enzimas para este propósito , a veces solo EDTA en solución salina fisiológica (solución de Versen) es suficiente. Si el cultivo crece lentamente, generalmente se alimenta sin transferirlo a otro recipiente, periódicamente (generalmente una vez cada 2-3 días) retirando parte del medio usado y agregando fresco.
Transfección y transducción
El ADN extraño se puede introducir en las células durante su cultivo mediante transfección (método no viral). Esta tecnología se utiliza a menudo para la expresión génica controlada . Hace relativamente poco tiempo, la transfección de ARNm se ha implementado con éxito para estos fines .
El ADN también puede ser introducido en el genoma de la célula por virus o bacteriófagos . Ellos, al ser parásitos intracelulares, son los más adecuados para estos fines, ya que la introducción de material genético en la célula huésped es una parte normal de su ciclo de vida [13] . Este método se llama transducción .
Líneas celulares humanas
El cultivo de células humanas va algo en contra de las reglas de la bioética , ya que las células cultivadas de forma aislada pueden sobrevivir al organismo original y luego usarse para realizar experimentos o para desarrollar nuevos tratamientos y beneficiarse de ello. La primera decisión judicial en esta área se dictó en la Corte Suprema de California en John Moore v. University of California , según la cual los pacientes no tienen ningún derecho de propiedad sobre las líneas celulares obtenidas de los órganos extraídos con su consentimiento [14] .
Hibridoma
Un hibridoma es una línea celular resultante de la fusión de linfocitos normales con células cancerosas "inmortales". Se utiliza para producir anticuerpos monoclonales . Los leucocitos aislados del bazo o de la sangre de animales inmunizados producen anticuerpos con la especificidad requerida, pero como ocurre con cualquier cultivo primario, su capacidad de proliferación está limitada por el límite de Hayflick . Para la inmortalización, se fusionan artificialmente con una línea celular de mieloma "inmortal" , lo que da como resultado una recombinación de rasgos. Después de eso, la línea se clona y se seleccionan los clones que son capaces simultáneamente de una proliferación ilimitada y de producir anticuerpos contra el antígeno seleccionado .
Uso de cultivos celulares
El cultivo celular masivo es la base para la producción industrial de vacunas virales y una variedad de productos biotecnológicos .
Productos biotecnológicos
Un método industrial a partir de cultivos celulares produce productos como enzimas , hormonas sintéticas , anticuerpos monoclonales , interleucinas , linfoquinas , fármacos antitumorales . Aunque muchas proteínas simples se pueden obtener con relativa facilidad usando rDNA en cultivos bacterianos, las proteínas más complejas, como las glicoproteínas, actualmente solo se pueden obtener de células animales. Una de estas importantes proteínas es la hormona eritropoyetina . El costo de cultivar cultivos de células de mamíferos es bastante alto, por lo que actualmente se está investigando la posibilidad de producir proteínas complejas en cultivos de células de insectos o plantas superiores .
Cultivos de tejidos
El cultivo celular es una parte integral de la tecnología de cultivo de tejidos y la ingeniería de tejidos, ya que define la base para cultivar células y mantenerlas en un estado viable ex vivo .
Vacunas
Utilizando técnicas de cultivo celular, actualmente se están produciendo vacunas contra la poliomielitis , el sarampión , las paperas , la rubéola y la varicela . Debido a la amenaza de una pandemia de influenza causada por la cepa H5N1 del virus, el gobierno de los Estados Unidos actualmente financia la investigación de una vacuna contra la influenza aviar utilizando cultivos celulares.
Cultivos de células no mamíferas
Cultivos de células vegetales
Los cultivos de células vegetales generalmente se cultivan como una suspensión en un medio nutritivo líquido o como un cultivo de callos sobre una base nutritiva sólida. El cultivo de células indiferenciadas y callos requiere mantener un cierto equilibrio de hormonas de crecimiento vegetal, auxinas y citoquininas .
Cultivos de bacterias y levaduras
Para el cultivo de una pequeña cantidad de células bacterianas y de levadura , las células se sembraron en un medio nutritivo sólido a base de gelatina o agar-agar . Para la producción en masa, se utiliza el cultivo en medios nutritivos líquidos (caldos).
Cultivos virales
Los cultivos de virus se cultivan en cultivos de células de mamíferos , plantas , hongos o bacterias , dependiendo del huésped natural del tipo particular de virus . Pero bajo ciertas condiciones, pueden crecer en células de un tipo diferente.
En este caso, el propio cultivo celular sirve como medio para el crecimiento y replicación del virus.
Tipos de líneas celulares
Lista corta de líneas celulares
La lista de las líneas celulares más comunes que se proporciona aquí no es exhaustiva.
| línea celular | Explicación de la abreviatura | organismo | Textil | Morfología | Notas y enlaces | |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 293-T | humano | riñón (embrionario) | Derivado de HEK-293 ECACC | |||
| células 3T3 | "Transferencia de 3 días, inóculo 3 x 105 células" | ratón | fibroblastos embrionarios | También conocido como NIH 3T3 CLS ECACC | ||
| 721 | humano | melanoma | ||||
| 9L | rata | glioblastoma | ||||
| A2780 | humano | ovario | cáncer de ovarios | ECACC | ||
| A2780ADR | humano | ovario | derivado de A2780 con resistencia a adriamicina | ECACC | ||
| A2780cis | humano | ovario | derivado resistente al cisplatino de A2780 | ECACC | ||
| A172 | humano | glioblastoma | glioma maligno | CLS ECACC | ||
| A431 | humano | epitelio de la piel | carcinoma de células escamosas | Base de datos de líneas celulares CLS ECACC | ||
| A-549 | humano | carcinoma de pulmón | epitelio | CLS DSMZ ECACC | ||
| B35 | rata | neuroblastoma | ATCC (enlace no disponible) | |||
| BCP-1 | humano | leucocitos periféricos | Linfoma VIH+ | ATCC | ||
| BEAS-2B | epitelio bronquial + adenovirus Híbrido de virus 12-SV40 (Ad12SV40) | humano | pulmones | epitelio | ATCC (enlace no disponible) | |
| bfin.3 | endotelial cerebral | ratón | corteza | endotelio | ATCC | |
| BHK-21 | "Riñón de hámster bebé" | hámster | brote | fibroblastos | CLS ECACC Olympus Archivado el 27 de diciembre de 2009 en Wayback Machine . | |
| BR 293 | humano | seno | cangrejo de río | |||
| BxPC3 | Xenografía de biopsia de carcinoma de páncreas línea 3 | humano | adenocarcinoma de páncreas | epitelio | ATCC (enlace no disponible) | |
| C3H-10T1/2 | ratón | células mesenquimales embrionarias | ECACC | |||
| C6/36 | Aedes albopictus (mosquito) | tejido larvario | ECACC | |||
| CHO | ovario de hamster chino | hámster gris (Cricetulus griseus) | ovario | epitelio | CLS ECACC ICLC (enlace no disponible) | |
| COR-L23 | humano | pulmones | ECACC | |||
| COR-L23/RCP | humano | pulmones | ECACC | |||
| COR-L23/5010 | humano | pulmones | ECACC | |||
| COR-L23/R23 | humano | pulmones | epitelio | ECACC | ||
| COS-7 | Cercopithecus aethiops, origen defectuoso SV-40 | mono Cercopithecus aethiops | brote | fibroblastos | CLS ECACC ATCC | |
| LMC T1 | Leucemia mieloide crónica linfocito T 1 | humano | leucemia mieloide crónica | leucemia de células T | Sangre | |
| CMT | tumor mamario canino | perro | seno | epitelio | ||
| D17 | perro | osteosarcoma | ECACC | |||
| DH82 | perro | histiocitosis | monocitos/macrófagos | ECACC | ||
| DU145 | humano | carcinoma | próstata | CLS | ||
| DuCaP | Duramadre Cáncer de próstata | humano | cáncer de próstata metastásico | epitelio | 11317521 | |
| EL4 | ratón | leucemia de células T | ECACC | |||
| EMT6/AR1 | ratón | seno | epitelio | ECACC | ||
| EMT6/AR10.0 | ratón | seno | epitelio | ECACC | ||
| FM3 | humano | metástasis a un ganglio linfático | melanoma | |||
| H1299 | humano | pulmones | cangrejo de río | |||
| H69 | humano | pulmones | ECACC | |||
| HB54 | hibridoma | hibridoma | secreta MA2.1 mAb (contra HLA-A2 y HLA-B17) | Revista de inmunología | ||
| HB55 | hibridoma | hibridoma | secreta L243 mAb (contra HLA-DR) | inmunología humana | ||
| HCA2 | humano | fibroblastos | Revista de Virología General | |||
| HEK-293 | riñón embrionario humano | humano | riñón (embrionario) | epitelio | CLS ATCC | |
| hela | Henrietta carece | humano | cáncer de cuello uterino | epitelio | CLS DSMZ ECACC | |
| Hepa1c1c7 | clon 7 del clon 1 hepatoma linea 1 | ratón | hepatoma | epitelio | ECACC
ATCC (enlace no disponible) | |
| HL-60 | leucemia humana | humano | mieloblastos | células de sangre | CLS ECACC DSMZ | |
| HMEC | célula epitelial mamaria humana | humano | epitelio | ECACC | ||
| HT-29 | humano | epitelio colónico | adenocarcinoma | HT-29 ECACC | ||
| Jurkat | humano | leucemia de células T | células blancas de la sangre | ECACC | ||
| JY | humano | linfoblastos | Células B inmortalizadas por EBV | |||
| K562 | humano | linfoblastos | leucemia mieloide crónica | CLS ECACC | ||
| Ku812 | humano | linfoblastos | eritroleucemia | ECACC | ||
| KCL22 | humano | linfoblastos | leucemia mieloide crónica | |||
| KYO1 | Kioto 1 | humano | linfoblastos | leucemia mieloide crónica | DSMZ | |
| LNCap | Ganglio linfático Cáncer de próstata | humano | adenocarcinoma de próstata | epitelio | CLS ECACC ATCC (enlace no disponible) | |
| Mamá Mel 1, 2, 3….48 | humano | líneas celulares de melanoma | ||||
| MC-38 | ratón | adenocarcinoma | ||||
| MCF-7 | Fundación del Cáncer de Michigan-7 | humano | seno | carcinoma ductal invasivo de mama | RE+, PR+ | CLS |
| MCF-10A | Fundación del Cáncer de Michigan | humano | seno | epitelio | ATCC | |
| MDA-MB-231 | MD Anderson-Mama metastásica | humano | seno | cangrejo de río | ECACC | |
| MDA-MB-468 | MD Anderson-Mama metastásica | humano | seno | cangrejo de río | ECACC | |
| MDA-MB-435 | MD Anderson-Mama metastásica | humano | seno | melanoma o carcinoma (sin consenso) | Cambridge Patología ECACC | |
| MDCK II | Riñón canino Madin Darby | perro | brote | epitelio | CLS ECACC ATCC | |
| MOR/0.2R | humano | pulmones | ECACC | |||
| NCI-H69/RCP | humano | pulmones | ECACC | |||
| NCI-H69/LX10 | humano | pulmones | ECACC | |||
| NCI-H69/LX20 | humano | pulmones | ECACC | |||
| NCI-H69/LX4 | humano | pulmones | ECACC | |||
| NIH-3T3 | Institutos Nacionales de Salud, transferencia de 3 días, inóculo 3 x 10 5 células | ratón | embrión | fibroblastos | CLS ECACC ATCC | |
| NALM-1 | Sangre periférica | leucemia mieloide crónica | Genética y citogenética del cáncer | |||
| NW-145 | melanoma | ESTDAB Archivado el 16 de noviembre de 2011 en Wayback Machine . | ||||
| OPCN/OPCT | Onyvax [1] Cáncer de próstata…. | humano | lineas celulares de cancer de prostata | Asterand Archivado el 7 de julio de 2011 en Wayback Machine . | ||
| par | humano | leucemia de células T | DSMZ | |||
| PNT-1A / PNT 2 | lineas celulares de cancer de prostata | ECACC | ||||
| RenCa | Carcinoma renal | ratón | carcinoma renal | CLS | ||
| RIN-5F | ratón | páncreas | ||||
| RMA/RMA | ratón | cáncer de células T | ||||
| saos-2 | humano | osteoxarcoma | CLS ECACC | |||
| Sf-9 | Spodoptera frugiperda | mariposa Spodoptera frugiperda | ovario | CLS DSMZ ECACC | ||
| SkBr3 | humano | carcinoma de mama | CLS | |||
| T2 | humano | hibridoma de células B y leucemia de células T | DSMZ | |||
| T-47D | humano | seno | carcinoma de conducto | CLS | ||
| T84 | humano | carcinoma de colon/metástasis de pulmón | epitelio | [2] ECACC ATCC | ||
| THP1 | humano | monocitos | leucemia mieloide aguda | CLS ECACC | ||
| U373 | humano | glioblastoma-astrocitoma | epitelio | |||
| U87 | humano | glioblastoma-astrocitoma | epitelio | CLS Abcam | ||
| U937 | humano | linfoma monocítico leucémico | CLS ECACC | |||
| VCaP | Vértebra Cáncer de próstata | humano | cáncer de próstata metastásico | epitelio | ECACC ATCC Archivado el 19 de febrero de 2012 en Wayback Machine . | |
| verón | 'Vera Reno' ('brote verde') / 'Vero' ('verdadero') | mono verde africano | epitelio renal | CLS ECACC | ||
| WM39 | humano | cuero | melanoma primario | |||
| WT-49 | humano | linfoblastos | ||||
| X63 | ratón | melanoma | ||||
| YAC-1 | ratón | linfoma | Base de datos de líneas celulares CLS ECACC | |||
| año | humano | linfocitos B | VEB transformado | [3] Inmunología humana Archivado el 20 de septiembre de 2008 en Wayback Machine . |
Véase también
- inmortalidad biológica
- cultivo de tejidos
- Órganos en crecimiento
- Biotecnología
- células madre inducidas
- nicho de células madre
- Medio de cultivo de embriones
- Cultivo de células y tejidos
Notas
- ↑ Solución de Ringer
- ↑ Copia archivada (enlace no disponible) . Consultado el 24 de marzo de 2009. Archivado desde el original el 1 de septiembre de 2006.
- ↑ Las células pueden aislarse de los tejidos y dividirse en diferentes tipos (enlace inaccesible) . Fecha de acceso: 24 de marzo de 2009. Archivado desde el original el 26 de mayo de 2009.
- ↑ Laboratorio. Cultivo de células y tejidos . www.primer.ru (2003). Consultado el 27 de marzo de 2010. Archivado desde el original el 10 de mayo de 2003.
- ↑ Telomerasa . Materia oscura (15 de septiembre de 2006). Consultado: 27 de marzo de 2010.
- ↑ Maqsood MI, Matin MM, Bahrami AR, Ghasroldasht MM (2013). Inmortalidad de las líneas celulares: desafíos y ventajas del establecimiento. Biología Celular Internacional. 37(10), 1038–1045. doi : 10.1002/cbin.10137 PMID 23723166
- ↑ Incubadoras de CO2 Binder (Alemania) . Servicio tecnico . Consultado el 27 de marzo de 2010. Archivado desde el original el 19 de noviembre de 2012.
- ↑ Equipos y consumibles de laboratorio. Incubadoras (2007). Consultado el 27 de marzo de 2010. Archivado desde el original el 8 de junio de 2012.
- ↑ Con la ayuda de medios de una determinada composición química, se pueden identificar factores de crecimiento específicos (enlace inaccesible) . Consultado el 24 de marzo de 2009. Archivado desde el original el 10 de noviembre de 2007.
- ↑ Solución de lipoproteínas purificadas LipiMAX de suero bovino . Servicios Biológicos de Selborne (2006). Consultado el 27 de marzo de 2010. Archivado desde el original el 8 de junio de 2012.
- ↑ Lundup A.V., Demchenko A.G., Tenchurin T.Kh., Krasheninnikov M.E., Klabukov I.D., Shepelev A.D., Mamagulashvili V.G., Oganesyan R.V., Orekhov A.S., Chvalun S.N., Dyuzheva T.G. Mejora de la eficiencia de colonización de matrices biodegradables por células estromales y epiteliales durante el cultivo dinámico // Genes and Cells. - 2016. - T. 11 , N º 3 . - S. 102-107 . — ISSN 2313-1829 .
- ↑ Guller A.E., Grebenyuk P.N., Shekhter A.B., Zvyagin A.V., Deev S.M. Ingeniería de tejidos de tumores utilizando tecnologías de biorreactor // Acta Naturae (versión rusa). - 2016. - T. 8 , N º 3 . - S. 49-65 . — ISSN 2075-8243 .
- ↑ Mecanismo de infección por virus
- ↑ V. Bogomolova. ¿Quién es dueño de nuestro cuerpo? . Arcano (3 de agosto de 2009). Consultado el 27 de marzo de 2010. Archivado desde el original el 5 de marzo de 2016.
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